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随着老龄化进程的加快,心脑血管疾病、慢性呼吸系统疾病、糖尿病等慢性病在疾病总负担中所占的比例逐年上升,已经成为限制寿命延长的重要影响因素,深入开展延缓衰老和降低衰老有关疾病的研究是应对老龄化挑战的重要举措之一。近年研究发现,衰老的形成机制复杂,可导致年龄相关的微血管和大血管疾病,其中微循环障碍是主要机制之一。随着机体衰老,与年龄相关的内皮功能紊乱、血管生成受损以及随后的组织灌注受损,导致微循环障碍,从而加剧了老年患者心脑血管功能的下降。内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPCs）移植是治疗心脑血管疾病的重大突破,自体EPCs移植和通过药物动员EPCs有助于血管修复和新生血管形成,从而改善微循环障碍。然而EPCs的数量会随着年龄的增长而减少,并且EPCs的提取也很困难,当单独移植时,只有少数存活,需要改善体内环境来增强EPCs的修复功能,而中药具有多靶点和用药安全灵活的特点,因此优化移植方案利用中药联合EPCs移植对于治疗年龄相关的心脑血管疾病有临床应用价值。前期的实验证明,D-半乳糖（D-Galactose,D-gal）构建的亚急性脑老化动物模型可在短时间内诱导,衰老的机理和特征与自然衰老相似,而益气活血养阴方可以通过保护大血管功能来延缓心脏与主动脉衰老。因此通过构建D-半乳糖诱导亚急性衰老小鼠模型,探讨益气活血养阴方对于衰老过程中脑微循环的影响,并开展联合EPCs移植改善脑微循环障碍的可行性,对于探索中药联合干细胞移植、改善微循环障碍、防治衰老相关脑血管病变具有重要的意义。目的:观察D-半乳糖诱导的脑老化小鼠脑微循环的变化及益气活血养阴方联合EPCs移植对衰老小鼠脑微循环障碍的干预作用。方法:通过连续10周给予8周龄SPF级雄性C57BL/6N小鼠颈背部皮下注射D-gal溶液（180mg/kg/d）构建D-半乳糖诱导亚急性脑老化小鼠模型,并以小鼠脑微循环为研究对象,实验动物分为空白对照组、衰老模型组、中药联合EPCs移植组、EPCs移植组和二甲双胍联合EPCs移植组。空白对照组每天在背部皮下注射相同体积的生理盐水。造模2周后,各组动物灌胃给药,空白组和模型组给予蒸馏水,其余各组动物给予相应药物连续干预8周,空白组小鼠正常饲养,不进行干预。在造模后的第8周将通过慢病毒转染包装后的EPCs通过尾静脉注射进行移植,对EPCs组、中药组、二甲双胍组注射EPCs,每组注射含1×106的EPCs混悬液0.25ml,衰老模型组、空白对照组注射PBS缓冲液0.25ml。EPCs的提取、培养、鉴定、转染和移植,用荧光显微镜和小动物活体光学二维成像系统观察EPCs的慢病毒转染和移植是否成功;观察小鼠的一般状态,旷场实验观察小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为学变化;使用激光散斑血流成像系统测量小鼠脑部的血流量并形成可视化血流分布图。HE染色和Nissl染色检测小鼠脑组织病理形态学改变;TUNEL染色观察小鼠脑组织细胞凋亡情况;免疫荧光染色观察并检测小鼠脑部血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD 31）和 CD 105（Endoglin）的表达水平;免疫组化染色观察并检测小鼠脑部中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）、血管内皮衍生的生长因子VEGF（vascular endothelial-derived growth factor,VEGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2,MMP-2）、晚期糖基化终末产物（advanced glycationend products,AGE）的表达水平;Western blot检测小鼠脑组织中内皮紧密连结蛋白（claudin-5）、闭合蛋白（Occludin）、闭锁连接蛋白-1（ZO-1）的表达情况;检测血清中一氧化氮（Nitric Oxide,NO）含量、丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量、总超氧化歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、及内皮素-1（endothelin-1,ET-1）含量的变化。结果:1)与空白对照组相比,衰老模型组小鼠状态较差,体重增长率降低（P＜0.05）;旷场实验中,活动次数、中央区域活动路程均减少（P＜0.05）;脑血流灌注量减少;脑组织局部细胞变性,结构排列紊乱,细胞核固缩,神经元数量减少,细胞凋亡增多;血清SOD活力下降,MDA含量升高（P＜0.05）,脑组织中衰老蛋白AGE和MMP-2表达水平明显升高（P＜0.01）,脑老化明显;神经炎症相关蛋白GFAP表达明显升高（P＜0.01）,CD 31蛋白表达减少,VEGF、CD 105蛋白表达显著减少（P＜0.01）,血管生成减少,微血管密度降低,血清NO含量降低、ET-1含量升高（P＜0.05）,内皮功能障碍;小鼠脑组织血脑屏障相关ZO-1、Occludin、Claudin-5（P＜0.05）蛋白表达降低,血脑屏障功能受损。2)与衰老模型组相比,各给药联合移植组小鼠体重增长率均较衰老模型组好（P＜0.05）;小鼠自主活动和探索行为能力增强;中药联合EPCs移植组平均脑血流灌注量显著升高（P＜0.01）,且治疗效果要优于单独移植和二甲双胍联合移植组,小鼠脑组织内细胞排列致密整齐,神经元和尼氏体数量增加,细胞间距缩小,细胞凋亡减少;血清SOD活力升高、MDA含量降低（P＜0.05）,脑组织中AGE和MMP-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）;血清NO含量升高、ET-1含量降低（P＜0.05）,神经炎症相关蛋白GFAP表达升高（P＜0.05）,VEGF、CD 31、CD 105蛋白表达增强（P＜0.01）,血管内皮功能改善,血管生成增多,微血管密度增强,小鼠脑组织血脑屏障相关ZO-1、Occludin、Claudin-5 蛋白表达升高（P＜0.05）。结论:D-半乳糖诱导的脑老化小鼠体内出现了脑部神经元数目减少,细胞凋亡增多,血管内皮功能紊乱、微血管生成减少,导致微血管密度下降、脑血流灌注量减少、血脑屏障功能受损等微循环障碍的表现,即D-半乳糖可以诱导小鼠脑血管衰老从而导致脑部微循环障碍。而益气活血养阴方能改善不利于EPCs生长和分化的生存环境,协同EPCs改善D-半乳糖诱导的小鼠脑微循环障碍情况,充分发挥脑保护作用,优化干细胞移植方案,延缓血管衰老进程。