论文部分内容阅读
目的:流感病毒基因组UTR可变区的碱基多态性可影响其基因的转录、复制和翻译,从而影响病毒的生物学特性。本研究利用本课题组前期自主构建的RNA聚合酶I EGFP荧光报告系统,即新发禽流感病毒H5N6/H7N9/H9N2的HA/NA-3’UTR-EGFP-5’UTR随机突变库。从其中随机挑选各亚型的突变克隆,定性及定量分析EGFP基因的表达情况。测序鉴定EGFP报告基因上调的HA/NA-UTR突变克隆并分析导致EGFP表达上调的UTR可变区特异SNP特征。同时利用自主构建的双向反向遗传学体系包装H9N2流感病毒和UTR区突变病毒,测定并比较其病毒感染力,从而探讨流感病毒UTR区的基因突变对病毒感染能力变化的影响。方法:1.从随机突变库中筛选EGFP表达上调株:采用实验室构建的由HA/NA-UTR随机突变RNA聚合酶I荧光报告系统(HA/NA-3’UTR-EGFP-5’UTR)组成的突变库,从HA/NA-UTR随机突变库的H5/H7/H9和N2/N6/N9亚型中分别随机挑选突变克隆,将突变克隆转染至由H1N1染毒的MDCK细胞,通过荧光显微镜观察EGFP基因的荧光表达情况,利用多功能酶标仪测定报告基因(EGFP)的相对荧光值,并且采用real-time PCR法定量检测报告基因m RNA的相对表达量,从而筛选出导致报告基因表达上调的HA/NA-UTR突变克隆。2.比对分析报告基因表达上调株的序列特征:通过测序已知突变克隆的基因序列,利用Mega 7软件比对上调株和野生型的序列之间的碱基差异,分析具体位点的突变情况,从而探讨流感病毒UTR区的多位点突变导致HA和NA基因表达发生上调。3.双向反向遗传学系统的构建及病毒的包装:利用双向反向遗传学系统构建H9N2八质粒系统,将八质粒体系转染至293T和MDCK细胞中,包装出H9N2流感病毒以及具有明显突变特征的N2-UTR突变病毒。通过血凝实验计算病毒滴度和TCID50实验计算导致半数组织培养细胞病变所需的病毒量,从而比较UTR突变病毒感染能力的变化。结果:1.根据荧光显微镜观察、多酶标仪测定荧光值及real-time PCR定量检测Ct值的实验结果发现:在随机挑选的18株UTR突变株中,实验组H5-8、H7-7、H7-8、H9-8、N2-2、N9-7突变克隆的荧光强度、基因相对表达量与野生型相比有明显上调趋势,且统计学差异性显著。2.上调株与野生型的序列比对情况:H5-8(3’UTR:U4→A4,G17→A17,U18→A18,U19→A19,G21→A21,A22→G22,G25→U25;5’UTR:C24→A24,C27→G27,C31→U31,G35→A35,C36→U36,C40→U40,A42→G42,U44→G44,U45→G45,U46→C46)、H7-7(3’UTR:U17→A17,A22→G22,U33→C33;5’UTR:A4→G4,G5→A5,C8→A8,G11→U11,G12→C12,U14→A14,G15→A15,U16→C16,U17→C17,C28→G28,U29→G29)、H7-8(3’UTR:U17→A17,A18→G18,A22→G22,A26→C26,U33→G33;5’UTR:A4→U4,G5→A5,A9→U9,G11→A11,G12→A12,U14→G14,G15→U15,U16→G16,U17→C17,A25→C25,C28→G28)、H9-8(3’UTR:U4→C4,U16→C16,A17→C17,G20→C20,U21→A21,G25→U25,G26→C26;5’UTR:A8→G8,C24→A24,U27→C27)、N2-2(3’UTR:U13→C13;5’UTR:C22→U22)、N9-7(3’UTR:U4→C4,G16→A16;5’UTR:U25→A25,C26→U26,A27→C27),其中N2-2上调株具有明显突变特征。3.成功构建H9N2双向反向遗传学系统,包装出H9N2流感病毒及其NA-UTR突变病毒。4.根据血凝实验和TCID50实验结果,N2-2-3’UTR和N2-2-3’/5’UTR突变病毒相比野生型(H9N2流感病毒)的感染能力增强。结论:从随机突变库中成功挑选出H5-8/H7-7/H7-8/H9-8/N2-2/N9-7突变克隆的EGFP基因表达上调,且具有统计学意义;成功构建出H9N2双向反向遗传学的八质粒系统,并拯救出H9N2流感病毒及其NA-UTR突变病毒,为进一步探究甲型流感病毒UTR区的碱基多态性对病毒功能性影响,以及新发禽流感病毒发生的分子机制研究奠定基础。同时,今后流感病毒可能会发生变异甚至出现新的亚型,将会重点关注该位点碱基突变情况,这对流感病毒的有效防控提供重要的参考作用。