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目的 脓毒症是一种由全身感染反应的临床综合征,随着病程发展会引起过度的全身性炎症,并导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）。而肠道在脓毒症的发生和发展中发挥关键作用。故本研究从抗炎及肠黏膜屏障保护的角度,通过体内实验探索三叶青对脓毒症肠黏膜损伤的影响,并对网络药理学预测靶点及机制进行验证。为临床更有效的治疗脓毒症提供了新思路。方法 1.首先搜索中国知网（CNKI）、PubMed数据库文献收集三叶青活性成分及作用靶标,再通过搜索TCMSP数据库,以口服生物利用度（oralbioavailability,OB）≥30%,类药性（druglikeness,DL）≥0.18,收集所得活性成分并对各成分的作用靶点进行归纳整合;从Gene Cards和OMIM数据库中收集脓毒症疾病靶点,构建三叶青-化合物-靶标-脓毒症网络;并使用STRING数据库构建蛋白相互作用网络,采用DAVID数据库进行GO功能及KEGG通路富集分析,预测三叶青治疗脓毒症的作用靶点及机制。2.然后将72只SPF级ICR雄性小鼠随机分为正常组、模型组、三叶青高、中、低剂量组（SYQ-G、Z、D）、地塞米松组（DSMS）和培菲康组（PFK）。造模前治疗组连续给药7天,正常组、模型组给予等量体积蒸馏水,末次灌胃1小时后腹腔注射LPS（10mg/kg）建立脓毒症肠黏膜损伤小鼠模型,并在3小时后进行取材。利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测脓毒症小鼠血液和结肠组织中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CRP、PCT和iFABP含量的变化;乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒测定肠道LDH的水平;WB检测肠道组织中IL-6、TNF-α和IL-1β炎症相关蛋白;苏木精-伊红染色法（HE）比较各组小鼠回肠和盲肠黏膜组织病理变化及对肠道损伤程度进行评分。通过上述方法探究三叶青对脓毒症肠道炎症和损伤程度的影响。3.为了评估三叶青对脓毒症肠黏膜屏障功能的影响,利用透射电镜法观察肠黏膜上皮细胞紧密连接情况;β-葡萄糖醛酸苷酶（β-GD）试剂盒法测定β-GD含量变化;蛋白免疫荧光法检测紧密连接Claudin-5和ZO-1的表达情况;WB检测肠道组织中紧密连接蛋白（Occludin）的表达;qRT-PCR法测定Occludin、Claudin-5 和ZO-1的mRNA表达情况。免疫组化或WB实验方法观察肠上皮细胞凋亡蛋白Bax/Bcl2和Cleaved caspase3的表达情况;TUNEL法检测肠道细胞凋亡情况;4.最后利用WB检测肠道组织中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路表达的变化,qRT-PCR法测定MLCK和MLC的mRNA表达情况,进一步探索三叶青干预脓毒症的作用机制。结果 1.从网络药理学分析结果可知,三叶青中10个潜在活性成分可作用于脓毒症,三叶青与脓毒症共同的关键靶点有124个;主要涉及TNF、IL-6、IL-1β、IL-10和Caspase-3等关键靶点。GO功能富集分析得到共837个条目,主要涉及凋亡、炎症反应等;KEGG通路富集分析得到120条信号通路,其中PI3K-Akt、TLR和NF-κB等信号通路与炎症有关。2.通过与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中的CRP、PCT、iFABP和LDH显著升高（P＜0.05,0.01）,三叶青干预后减轻（P＜0.05,0.01）,从而发挥抗脓毒症的作用;在脓毒症肠损伤小鼠模型中,三叶青能够降低血清或结肠组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量和蛋白表达（P＜0.05,0.01）,而显著升高IL-10（P＜0.05,0.01）,从而减轻脓毒症的炎症反应;模型组小鼠肠道组织发生上皮细胞脱落、肠黏膜水肿、炎性细胞浸润和绒毛钝化,三叶青干预后肠道病理损伤减轻。3.三叶青通过减轻回肠组织中肠黏膜细胞间紧密连接被破坏、超微结构损伤和上皮细胞严重损伤的情况以及降低结肠组织中β-GD含量（P＜0.05）;并且通过与模型组比较,三叶青可以显著升高脓毒症小鼠回肠和结肠组织中紧密连接蛋白Occludin、Claudin-5和ZO-1蛋白和mRNA的表达（P＜0.05,0.01）,从而修复肠黏膜屏障损伤;与正常组比较,模型组小鼠Bax/Bcl2和Cleavedcaspase3表达升高（P＜0.05,0.01）,三叶青较模型组下降（P＜0.05,0.01）;为了进一步验证三叶青对肠道组织凋亡的影响,通过与模型组比较,三叶青干预后回肠组织凋亡减少,降低肠道组织细胞凋亡;4.与正常组比较,模型组小鼠结肠组织中TLR4、MyD88及p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达显著升高（P＜0.05,0.01）,MLCK和MLC的mRNA表达升高（P＜0.01）,三叶青干预后均显著下降（P＜0.05,0.01）,发现三叶青可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化,阻止MLCK和MLC的表达,减轻脓毒症肠黏膜损伤。结论 本研究证实三叶青可通过抑制炎症反应的发生有效控制脓毒症病程的发展从而进一步减轻肠黏膜的通透性、维持肠黏膜屏障功能的完整性,进而有效缓解脓毒症肠黏膜损伤,其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的活化有关。