【摘 要】
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目的:菊科泽兰属植物华泽兰Eupatorium chinense L.为我国传统中草药,具有清热解毒,疏肝解郁等功效,其有效成分的活性早已有相关研究,具有抗肿瘤、抗菌消炎和清热解毒等药理作用,但它们产生作用的具体机制尚未见报道。因此,本研究以华泽兰有效部位（EChLESs）作为研究对象,以华泽兰对于肝的疏导保护作用为研究切入点,通过运用体内外模型对其进行有效性及安全性评价,并对其药效作用机制展开探
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目的:菊科泽兰属植物华泽兰Eupatorium chinense L.为我国传统中草药,具有清热解毒,疏肝解郁等功效,其有效成分的活性早已有相关研究,具有抗肿瘤、抗菌消炎和清热解毒等药理作用,但它们产生作用的具体机制尚未见报道。因此,本研究以华泽兰有效部位（EChLESs）作为研究对象,以华泽兰对于肝的疏导保护作用为研究切入点,通过运用体内外模型对其进行有效性及安全性评价,并对其药效作用机制展开探究。方法:1、MTT 法检测 EChLESs 对肝癌细胞株 Bel7402、SNU-387、HuH7、H22和正常肝细胞株L02的活力抑制作用;选用鼠肝癌细胞株H22建立的小鼠皮下移植瘤模型及人源肝癌细胞株Bel7402裸小鼠皮下移植瘤模型对EChLESs进行体内安全性及有效性评价。2、选择人源肝癌细胞株Bel7402、SNU-387,通过流式细胞术及Western Blotting检测EChLESs诱导细胞凋亡、DNA损伤、线粒体膜电位变化及脂质过氧化水平变化情况,检测相关蛋白表达水平的变化。3、通过Western Blotting、铁离子检测试剂盒和GSSG/GSH检测试剂盒评估EChLESs对肝癌细胞株Bel7402、SNU-387铁死亡诱导情况。以蛋白组学结果为导向,对EChLESs作用机制展开探究。通过AO染色法和透射电镜对细胞自噬和铁死亡进行形态学验证,并对p-mTOR、P62、LC3A、NCOA4、FTH1等关键蛋白表达水平进行检测。4、通过siRNA干扰Bel7402、SNU-387细胞中NCOA4的表达,并用Western Blotting检测干扰效果,用MTT法检测EChLESs对于两细胞株活力抑制作用是否发生改变。用Western Blotting考察添加蛋白合成抑制剂CHX后两株细胞内NCOA4表达水平受EChLESs处理前后的变化情况。5、用免疫组化法、Western Blotting法检测不同组别裸小鼠Bel7402移植瘤组织内NCOA4、GPX4和Caspase 3的表达水平。结果:1、EChLESs在较低浓度水平即可对Bel7402、SNU-387、HuH7、H22细胞活力产生较好的抑制作用,而对L02细胞毒性较低。小鼠H22皮下移植瘤及Bel7402裸小鼠移植瘤模型结果显示EChLESs在体内对于肿瘤的生长具有剂量依赖性较好的抑制作用,且对体重无明显影响,显示出其良好安全性。2、EChLESs诱导Be17402和SNU-387细胞凋亡、DNA损伤、线粒体膜电位产生变化并呈浓度和时间依赖性地提高胞内脂质过氧化水平。3、EChLESs引起Bel7402和SNU-387细胞中脂质过氧化、铁离子水平上升,谷胱甘肽水平下降,GPX4表达水平下降,表明EChLESs在Be17402,SNU-387细胞中激活了铁死亡途径。蛋白组学结果显示细胞自噬相关蛋白也有显著变化,Western Blotting结果显示EChLESs同时也诱导了两株细胞内的自噬及铁自噬。4、通过siRNA干扰降低NCOA4表达后,Be17402和SNU-387细胞对EChLESs的活力抑制作用敏感性降低。蛋白合成抑制剂结果表明EChLESs在两肝癌细胞株中均能延长NCOA4的半衰期。5、免疫组化及Western Blotting结果表明EChLESs能显著降低裸小鼠肿瘤组织内GPX4的表达水平并提高NCOA4的表达水平,同时能降低Caspase 3的表达水平。结论:华泽兰有效部位EChLESs在低浓度时即可对肝癌细胞产生显著的体内外抑制作用,体内研究表明其具有较好的安全性。进一步的研究表明,EChLESs可通过引起细胞凋亡诱发DNA损伤与线粒体损伤,同时可通过诱导细胞自噬与延缓NCOA4降解的铁自噬引发细胞铁死亡,并也具有体内的铁死亡与凋亡的诱导能力。本研究为开发肝癌治疗药物提供了一定的研究基础,也为传统草本药物新用途的开发提供新的思路。
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