背景:新生儿微生物群落的获取和定植是建立健康的宿主-微生物共生关系的关键。人体发生首次微生物定植的时间仍存在争议,已有研究表明婴幼儿的内在宿主微环境因素（例如胎龄）与外源性因素（例如分娩方式）可以推动生命早期微生物群落的定植和成熟,且宿主内在微环境因素起着更关键的作用。因此,产前阶段对子代微生物群落的定植至关重要,生物系统的发育可能决定胎儿微生物群落的定植和形成,并影响免疫系统的发育、代谢功能以及子代未来的健康状况。目前已有大量研究致力于探索婴幼儿肠道微生物结构特征并探讨其与儿童发育和健康的关系。然而,据我们所知,尚无研究描述通过辅助生殖技术孕育的新生儿的肠道微生物结构特征。辅助生殖技术是一种采用医疗辅助手段人为操纵配子、合子和胚胎以使不孕不育夫妇妊娠的技术,已成为全球各个生殖医疗中心治疗不孕不育夫妇的标准和普遍做法。自1978年在英国成功实践以来,全世界通过辅助生殖技术诞生人口总数已超过500万,目前我国“试管婴儿”人数已超过40万,且呈持续、快速增加趋势。然而目前尚不清楚与通过自然受孕出生的新生儿相比,通过辅助生殖技术受孕出生的新生儿早期肠道微生物结构是否存在显著差异。此外,新生儿微生物组成对其生长和发育的影响仍然未知。新生儿出生后首次排泄的胎便中存在的微生物反映了微生物群落在人体最早的定植和形成,在随后的几天中,新生儿肠道微生物结构会逐渐受到饮食,营养和医疗因素的影响。目的:通过16s r RNA测序技术,全面比较辅助生殖新生儿和自然受孕新生儿早期肠道微生物的组成,识别相对丰富度存在显著差异的微生物群落。并探讨辅助生殖治疗因素以及孕妇因素对差异微生物群落的影响,以及评估早期肠道微生物对子代生长发育的影响。方法:本研究采用前瞻性队列研究设计,共纳入118个辅助生殖家庭和91个自然受孕家庭。所有参与研究的家庭均来自中国国家出生队列研究项目（China National Birth Cohort（CNBC）Study）,CNBC研究的主要目的是全面比较通过辅助生殖技术妊娠与自然妊娠的出生结局,并系统地评估可能影响出生结局的环境和遗传因素。在本研究中,我们于2017年8月1日至2018年7月31日期间从南京市妇幼保健院和苏州市立医院共招募了228个家庭,并在孕妇分娩后24小时内采集到了新生儿首次胎便样本。随后,在信息整理阶段,如果缺少主要的孕产妇（例如辅助生殖治疗,孕前BMI）或新生儿（例如出生体重,满月体重）数据,或数据可疑,我们将这些家庭从本项研究中剔除,信息核查阶段共有19个家庭因不满足上述数据质量要求而被剔除。最终纳入研究分析的共有209个家庭,其中118名新生儿通过辅助生殖技术出生,91名新生儿通过自然受孕后出生。通过辅助生殖技术受孕和自然受孕的孕妇通过面访来完成标准化和结构化的电子问卷,以收集其人口基线信息和生殖生育史等。在分娩期间,从临床信息中收集妊娠结局信息,并摘录新生儿的体格测量数据。所有新生儿在出生后约42天,以及6月龄时,均至医院进行了健康检查和体格测量。除新生儿分娩后首次排泄的胎便,在条件允许的情况下,我们在其出生后住院期间每日采集一次粪便样本。对于粪便中微生物16s rRNA测序数据的处理,我们将超过97%的相似度的序列归为一个操作分类单元（Operational Taxonomic Units,OTUs）。选择每个分类单元的种子序列用于微生物群落注释。我们基于每个样本的微生物分类单元结构计算微生物α多样性和β多样性。通过非参数多元方差分析评估了辅助生殖组和自然受孕组胎便微生物结构的差异。通过单因素方差分析和线性判别分析鉴定了辅助生殖组和自然受孕组之间的差异微生物群落。我们使用索伦森指数来衡量个体内不同时间样本的微生物结构之间的相似性。最后,我们通过关联分析来探讨辅助生殖新生儿肠道微生物群落的影响因素,并研究了生命早期肠道微生物对新生儿生长发育的潜在影响。结果:本研究发现,与自然受孕出生的新生人相比,辅助生殖组新生儿出生后首次排泄的胎便中微生物α多样性（辛普森指数）降低（辅助生殖组:0.59±0.29;自然受孕组:0.68±0.28,P=0.03）。两组之间另外两种α多样性（Chao1指数和香农指数）差异无统计学意义。我们分析了通过剖宫产分娩的新生儿胎便微生物α多样性,并且仍观察到辅助生殖组剖宫产分娩新生儿胎便微生物辛普森指数较低（辅助生殖组:0.60±0.29;自然受孕组:0.78±0.28,P<0.001）。主坐标分析的图像显示,辅助生殖新生儿和自然受孕新生儿胎便微生物以组别为单位分开聚集,两组微生物结构差异有统计学意义（基于Bray-Curtis距离的非参数多元方差分析,P=0.001）。在自然受孕后出生的新生儿胎便样品中,相对丰富度最高的门水平分类微生物群落是变形菌门（相对丰富度均数±标准差:41.4%±36.3%）,其次是厚壁菌门（7.3%±32.8%）,而辅助生殖组新生儿胎便样品中,相对丰富度最高的是厚壁菌门（48.7%±35.8%）,其次是变形菌门（36.3%±36.0%）。在两组中,相对丰富度排在第三位的都是拟杆菌门（辅助生殖组:5.5%±8.4%;自然受孕组:10.5%±15.7%,P=0.01 after Bonferroni Correction）。在属水平分类的微生物群落中,我们观察到相比于自然受孕新生儿,辅助生殖组新生儿葡萄球菌属相对丰富度增加了1倍,而拟杆菌属相对丰富度减少了50%（葡萄球菌属:辅助生殖组:19.4%±33.0%;自然受孕组:7.9%±18.7%,P=0.03 after Bonferroni Correction;拟杆菌属:辅助生殖组:1.7%±3.5%;自然受孕组:4.5%±10.2%,P=0.04 after Bonferroni Correction）。在辅助生殖组新生儿中,母体既往是否有过妊娠经历与胎便中拟杆菌门相对丰富度相关(既往怀孕过相比于既往未曾怀孕:β_adj=-0.05,95%CI=-0.11,-0.002,P=4.11×10^-2)。我们发现经阴道使用黄体类支持药物相比于通过其他途径使用黄体类支持药物与拟杆菌门相对丰富度有较显著的正相关关系(β_adj=0.11,95%CI=0.04,0.17,P=1.79×10^-3)。相比之下,在辅助生殖治疗过程中使用拮抗剂方案促排卵相比于激动剂长方案,冷冻胚胎移植相较于新鲜胚胎移植都可显著降低辅助生殖新生儿胎便中拟杆菌门相对丰富度(促排卵方案:β_adj=-0.09,95%CI=-0.17,-0.02,P=1.90×10^-2;移植胚胎类型:β_adj=-0.06,95%CI=-0.12,-0.01,P=2.89×10^-2)。我们的研究还发现不论是辅助生殖组新生儿还是自然受孕组新生儿,胎便中微生物α多样性和拟杆菌门相对丰富度都与其早期体重增速成反比。辅助生殖组新生儿胎便微生物α多样性（辛普森指数）或拟杆菌门相对丰富度降低都与从出生至42天体重快速增加有关(辛普森指数:β_adj=-11.0,95%CI=-18.3,-3.63,P=4.13×10^-3;拟杆菌门相对丰富度:β_adj=-56.4,95%CI=-80.7,-32.0,P=1.42×10^-5)。在自然受孕出生新生儿中,出生至42天体重增速与拟杆菌门相对丰富度显著负相关(β_adj=-39.2,95%CI=-54.2,-24.2,P=1.83×10^-6),但与辛普森指数相关关系无统计学意义(β_adj=-7.20,95%CI=-17.5,3.12,P=1.75×10^-1)。结论:在这项前瞻性队列研究中,我们确定了通过辅助生殖技术受孕出生的新生儿肠道微生物结构的特征和影响因素,并提供了早期肠道微生物对婴幼儿生长发育的重要性的证据。