重组人促红细胞生成素预处理对缺血再灌注大鼠心肌的保护作用及相关机理研究 缺血性心脏病仍是目前威胁人类健康的最主要疾病之一，目前已有药物、溶栓以及介入等多种方法用于缺血性心脏病的治疗并有着满意的疗效。但冠脉再通的同时，有可能出现各种代谢障碍和功能紊乱，即心肌缺血再灌注(I-R)损伤，会导致以炎性反应、心肌梗死和心肌收缩功能障碍为特征的严重的损伤效应。随着心脏直视手术的普及，体外循环手术的逐步开展，寻求更新的防治I-R损伤的措施和研究显得日益重要。 促红细胞生成素(EPO)原本是机体缺氧状态下由肾脏合成的，刺激骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生分化的糖蛋白激素。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后约90％的EPO由由肾脏皮髓质交界处的肾小管间质细胞分泌。重组人促红细胞生成素(rhEPO)是利用基因工程人工合成的外源性EPO，与内源性EPO有着相同的氨基酸序列和生物特性，长期以来广泛用于临床治疗各种原因造成的贫血。近年来的研究表明，除了肝肾外的其他一些组织如神经元细胞、脑星型胶质细胞以及大鼠和人的心肌细胞均能表达产生EPO。EPO具有多种非血液系统生理效应，是一种多功能的组织保护因子，EPO及rhEPO对包括心、脑在内的多种器官组织的I-R损伤有显著的保护作用。本研究采用大鼠左前降支冠脉结扎再灌复制I-R模型，旨在验证rhEPO预处理对心肌I-R损伤的保护作用，并探讨其中可能的机制。 第一部分 rhEPO预处理对大鼠心脏缺血再灌注损伤保护作用的研究 防治MI-R损伤一直是研究关注的热点，目前已有许多药物和措施被证实其有效性，如钙拮抗剂，自由基清除剂、抗氧化剂(辅酶Q10)、腺苷、抑肽酶等等，还有近年来广泛提出的缺血预处理(IPC)。研究表明，EPO及rhEPO对包括心、脑在内的多种器官组织的I-R损伤有显著的与IPC相当的保护作用。EPO的脑保护作用研究的比较早，对于心脏的保护研究始见于2003年，其中大多数研究侧重于利用Langendorff装置观察rhEPO对I-R后心功能的影响，以及心肌细胞凋亡程度的检测。本部分实验采用大鼠左前降支冠脉结扎再灌复制I-R模型，针对rhEPO对在体大鼠MI-R后心肌梗死面积的影响、心肌超微结构的变化和缺血30min、再灌注0.5h、1h、2h和3h各时间点的血浆CK—MB表达水平再次证实rhEPO对大鼠心肌I-R损伤的保护作用。研究结果发现，单次注射rhEPO(5，000U/kg)预处理有着显著的心肌保护作用，明显降低了为期30min/3h的I-R后心肌梗死面积，改善了I-R损伤后心肌细胞中肌原纤维、细胞核、线粒体等超微结构并削弱了再灌注1h后血浆CK—MB水平的升高。 第二部分 rhEPO预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌炎性反应的影响和相关机制rhEPO长期以来广泛用于临床治疗各种原因造成的贫血。近年来大量研究表明EPO/rhEPO是一种多功能的组织保护因子，对包括心脑在内的多种组织器官的I-R损伤有保护作用。关于rhEPO的脑保护研究发现它能减轻脑缺血损伤时的炎性反应，减少前炎性细胞因子的释放和炎性细胞向损伤部位的迁移，还有研究报道rhEPO能促使血透患者体外培养的血细胞IL-10表达增高。本部分实验继续采用大鼠左前降支冠脉结扎再灌模型，着重观察rhEPO预处理对心肌I-R期间炎性反应的影响。仍然采用30min/3h的I-R模型，于再灌注末检测心肌组织MPO表达活性、组织学观察PMN对心肌的浸润情况，并测定I-R期间各时间点左室AAR区细胞因子浓度(TNF—α、IL—6以及IL-10)、ICAM-1 mRNA表达及转录因子(NF—κB和AP-1)活性。结果显示rhEPO预处理可以抑制I-R大鼠AAR区心肌组织转录因子的激活，降低TNF—α和IL—6的浓度和抑制ICAM-1 mRNA的表达，增强了IL-10的表达。rhEPO很可能是通过抑制I-R所致的NF—κB和AP-1的激活，下调促炎细胞因子和粘附分子的表达，减轻I-R所致的炎性反应来实现心肌保护作用。IL-10可能经其他独立途径发挥一定的正向协同作用。 第三部分环氧化酶-2介导rhEPO预处理对大鼠心肌延迟性保护效应的研究一些研究证实在IPC过程中存在环氧化酶-2(COX-2)表达和活性的上调，介导了IPC对心肌的延迟保护效应，降低心肌梗死和心肌钝抑的发生，更进一步的研究发现COX-2是IPC和许多PPC效应的一个关键环节。EPO/rhEPO有着和IPC相当的心肌保护作用，被认为是一种强效的PPC制剂，能诱导产生2小时之内的快速保护效应以及12-24h后的延迟保护效应。但COX-2在其中的作用还未有报道。因此本部分研究采用rhEPO和特异性COX-2抑制剂罗非昔布，欲探讨COX-2在EPO对心肌延迟保护效应中的作用。实验分为两阶段。第一阶段，我们采用前述I-R模型，通过观察30min/3h缺血再灌末心肌梗死面积和血浆CK—MB水平探讨COX-2是否参与了rhEPO的心肌保护作用。 结果显示COX-2抑制剂罗非昔布能完全阻断rhEPO预处理24小时后的心肌保护作用。第二阶段，我们检测了不同组别以及rhEPO预处理不同时间段后心肌组织COX-2 mRNA的表达以及PGE2和6-keto—PGF1α的含量。 结果表明，rhEPO预处理使得COX-2 mRNA表达增高的同时伴有COX-2活性的增强，PGE2和6-keto—PGF1α含量相比对照组显著升高，而加用罗非昔布后阻断了COX-2表达和活性的增强。这些结果表明，COX-2介导了rhEPO预处理的延迟性心肌保护效应，起着至关重要的作用，这种作用很可能与PGE2和/或PGI2的效用有关。总结我们运用大鼠左前降支冠脉结扎再灌复制I-R模型验证了rhEPO预处理对心肌I-R损伤的保护作用，发现rhEPO很可能是通过抑制I-R所致的转录因子NF—κB和AP-1的激活，下调炎症介质的表达，减轻炎性反应程度来实现心肌保护作用；还发现COX-2介导了rhEPO预处理24h后的延迟性心肌保护效应，起着至关重要的作用，这种作用很可能与PGE2和/或PGI2的效用有关。 rhEPO长期以来广泛用于临床治疗各种原因造成的贫血，显示了良好的耐受性和安全性，是一种方便实用的PPC制剂。随着研究的进一步深入，必将为有心血管事件风险和实行搭桥等心脏手术的患者提供更好的围手术期方案，为临床防治心脏缺血再灌注损伤提供新的策略。