论文部分内容阅读
人参是我国道地中药植物,其活性成分主要是次生代谢过程中产生的人参皂苷。深入研究人参皂苷生物合成途径关键酶基因的结构与功能,以及利用基因工程手段调控这些关键酶基因活性,达到调控提高人参皂苷含量的目的,将具有重要的理论和实际应用价值。本论文选择二个具有代表性的基因为研究对象,开展了基因克隆及利用反义RNA技术调控人参皂苷生物合成的尝试工作。这二个基因分别是人参皂苷生物合成上游关键酶基因,既催化异戊二烯途径第一个前体物-异戊烯二磷酸(IPP)合成焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(MVD),另一个基因是人参皂苷生物合成下游关键酶基因β-香树素合成酶基因(βAS),该基因编码的β-香树素合成酶是催化人参皂苷R0(人参次要活性成分)合成的关键酶。本论文用SMART RACE技术扩增人参MVD基因的保守序列,3’片段和5’片段,结果经过序列比对分析和拼接得到一个ORF为1254bp的片段,用此基因的ORF两端设计引物,扩增得到其cDNA全长。人参MVD基因在大肠杆菌中成功表达,其编码的蛋白分子量大小是46kd,与基因序列分析结果一致。(MVD基因在GenBank中的登录号:GQ455989)。利用反义表达策略,首次研究了βAS基因在人参皂苷生物合成中的功能。通过构建反义pBI121-AβAS植物表达载体,转入工程菌A4后转化人参根,对转化条件进行了筛选,获得反义人参发根系A5,A9,A19,A24和A30,Southern杂交结果显示目的基因拷贝数都是单拷贝。Northern杂交显示5株反义发根中的βAS转录水平显著下降,也说明反义βAS的导入确实可降低βAS的转录量,最多比对照组降低1/3。对酶活分析显示,反义发根系βAS活性均降低,同时,转基因发根系DAS活性被上调,DAS活性在所有的转化组中都获得增加,尤其在A19中增加了1.2倍。化学分析结果显示皂苷合成前体物2,3氧化鲨烯的积累增加。人参皂苷含量分析结果表明,齐敦果烷型人参皂苷R0含量均降低,最多降40%,转化发根的达玛烷型人参皂苷含量最高增加到原来的1.3倍,并且单体皂苷Rb1, Rb2, Rc, Rd,Re,Rf和Rg1均不同程度增加。这些研究成果对于促进MVD的异源表达、提高人参皂苷含量的种质资源的研究具有重要的指导作用,为调控人参皂苷的含量及人参代谢工程的研究奠定了理论和实践基础,具有广阔的应用前景。