牙周病(Periodontal disease)是指发生在牙周支持组织的疾病。牙周组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质)在机体内外因素等影响下发生的改变,例如:牙槽骨破坏性吸收,牙周膜充血、水肿、溶解、蜕变,牙骨质沉积受阻,牙齿松动,真性牙周袋形成,牙龈炎症、增生、萎缩等统称为牙周病。其中牙槽骨按解剖部份分为固有牙槽骨、密质骨、松质骨。牙槽骨的破坏性吸收是由于骨重建过程中牙槽骨病理或(和)生理的不平衡引起,是牙周病的主要特征之一。成骨细胞和破骨细胞的数量和比例决定骨组织的重建;同时,炎症因子、细胞活性、细胞凋亡、细胞生命周期性调节等都在骨组织重建过程中起着相当重要的作用。在众多炎症因子中肿瘤坏死因子就是其中研究的较详尽的一组。肿瘤坏死因子家族成员中的肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是与细胞凋亡关系最为密切的是肿瘤坏死因子,它参与多种细胞的凋亡调控。在局部病损的组织内有高浓度的肿瘤坏死因子-α聚集,TNF-α及其受体在骨吸收过程中起着重要的作用,影响细胞凋亡。牙周炎发生、进展、代谢的整个过程均有成骨细胞参与。牙菌斑(dental plaque)是牙周炎的始动因素。龈上菌斑和龈下菌斑包含大量的致病菌,其中革兰氏阴性厌氧菌是侵蚀性最强的一类。革兰氏阴性细菌细胞壁外膜上的主要成分是脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),具有破坏牙槽骨组织、促使牙周炎发展和恶化的作用。LPS可直接作用于牙周靶细胞,抑制牙周靶细胞的增殖和分化,加速牙周组织的吸收。鉴于上述原因,脂多糖在增加牙周炎发病率和促进牙槽骨吸收这一方面的特性也成为牙周病病因学研究的热点。研究证实,脂多糖和牙周炎病原体的代谢产物可以影响骨基质的形成和细胞凋亡,在这一过程中,成骨细胞的生物学效应尤其重要。牙槽骨的吸收或者骨质疏松是由于脂多糖引起的炎症反应和成骨细胞凋亡异常,从而导致骨吸收和骨形成之间的紊乱引起。现阶段尚无有效治疗由LPS诱导的骨破坏的药物。预防牙槽骨吸收和骨质流失的主要目的是探讨成骨细胞的保护功能和活动的不平衡状态,寻找潜在的药物治疗靶点。降钙素相关基因肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)是1971年首次从甲状腺髓样癌组织中提取的蛋白。CGRP由37个氨基酸组成,包括a-cgrp及b-cgrp两个异构体,最初是在感觉神经末梢被发现,以分泌颗粒的形式储存。随着研究的深入,近年来发现它存在于神经系统中,同时发现在骨组织、呼吸系统、心血管系统、消化系统等组织中均有CGRP的分布。CGRP在各种组织中呈现出多元生理学效应,还可控制相关的免疫应答。骨组织中CGRP的来源不仅仅是由感觉神经纤维末梢分泌,而且可以由成骨细胞以自分泌和旁分泌的形式生成,体外实验已经证实CGRP可促进成骨细胞的增殖、分化、增加细胞体积,同时在成骨细胞的表面发现有CGRP受体的存在。研究发现,CGRP作为神经系统和免疫系统的交叉点,在炎症中还具有潜在的调节作用,它不仅能够直接通过影响CD4+Thelper细胞,也可以通过影响抗原递呈细胞的功能调节适应性免疫反应。此外,CGRP还能够有效的抑制单核巨噬细胞和树突细胞释放炎症因子如TNF-α,IL-1β和CCl4。大量研究提示,让我们比较确定的是,CGRP作为一个潜在炎症调控者,可以抑制促炎因子的释放,且在炎症过程中发挥重要的调节作用,但是对于LPS诱导的成骨细胞损伤的调控机制,还不是十分清楚。在本次研究中,我们通过体外实验观察到牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)可以抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡;外源性地加入CGRP后,可以减弱这一作用。因此,本实验旨在探讨Pg-LPS对成骨细胞的损伤作用以及CGRP对这一过程的调控作用,进一步探讨炎症因子的调节机制,为牙周病的病因学研究提供理论基础。方法:(一)成骨细胞的原代培养选新生小鼠颅骨采用组织块培养法获取细胞。组织块消化后弃上清,收集组织块和游出的细胞,转入培养基,放致5%CO2孵箱中37℃培养。(二)细胞传代培养待细胞消化到开始收缩脱壁后转移致新的培养瓶进行细胞传代实验。本实验所采用的成骨细胞均是传至第3-4代的。细胞实验前均用无血清的培养液替换之前的含血清的培养液。孵箱中再继续培养成骨细胞24小时,其目的是使实验细胞均处在G0期。(三)成骨细胞鉴定实验组织块法培养的细胞都经相差显微镜行细胞形态学观察鉴定后再用碱性磷酸酶(ALP)染色法鉴定,再行下一步细胞实验。(四)Pg-LPS抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡1、Pg-LPS抑制成骨细胞活性的实验研究:实验一:以浓度分别为0、25、50、100、500、1000ng/mLPg-LPS进行实验,作用48h后收集细胞进行检测;实验二:用浓度为500ng/mL的Pg-LPS刺激成骨细胞,在不同时间点:0、6、12、24、48、72h后收集细胞进行细胞实验。两组均采用CCK8法检测Pg-LPS对成骨细胞的活性影响。2、Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡的实验研究:该实验的分组情况同上述CCK8实验。用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测盒检测Pg-LPS对成骨细胞凋亡的影响。(五)CGRP对Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡的调控作用1、Pg-LPS对CGRP表达的影响:Pg-LPS作用于成骨细胞后分别于0、6、12、24、48h收集细胞进行实验。检测Pg-LPS对成骨细胞CGRP含量的影响。2、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞活性的影响:外源性地加入浓度0、1、10、100、1000n M的CGRP,对同一浓度(500ng/ml)Pg-LPS作用后的成骨细胞进行检测。用CCK8法检测CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的活性影响。3、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞凋亡的影响:实验共4组:对照组、Pg-LPS组、CGRP组、CGRP+Pg-LPS组进行实验检测,用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒流式细胞学检测CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的凋亡影响。4、凋亡因子检测CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞活性的调控:上述细胞共培养48h后进行选用Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3抗体,运用蛋白免疫印迹法检测相关凋亡蛋白。(六)CGRP对Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡过程中TNF-a的表达影响1、Pg-LPS对成骨细胞炎症因子的影响:在成骨细胞中加入500 ng/mL Pg-LPS后于0、6、12、24、48h时终止细胞培养,用炎症因子试剂盒检测上清液中Pg-LPS对成骨细胞炎症因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2)的影响。2、CGRP对Pg-LPS作用下的成骨细胞炎症因子的影响:实验分为对照组和Pg-LPS、CGRP、Pg-LPS+CGRP 3个实验组,其中Pg-LPS+CGRP组成骨细胞先用100 n M CGRP作用30min后在加入500 ng/mL Pg-LPS作用48h后终止培养,用炎症因子试剂盒检测上清液中CGRP对Pg-LPS作用下的成骨细胞炎症因子(TNF-a、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2)的影响。3、CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞肿瘤坏死因子的影响:实验分为对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS 3个实验组,检测CGRP对Pg-LPS作用下的成骨细胞后TNF-α的影响。(七)TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中的作用1、TNF-α及CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的活性的影响:实验分组:对照组、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α,分别作用于成骨细胞后用CCK8法检测对成骨细胞活性的影响。2、TNF-α及CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞凋亡的影响:实验分组:对照组、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α,分别作用于成骨细胞后用Annexin V-FITC/PI法检测对成骨细胞凋亡的影响。3、凋亡因子检测TNF-α及CGRP对Pg-LPS作用下成骨细胞的活性的影响:实验分组:对照组、CGRP、CGRP+Pg-LPS实验组,收集细胞后运用Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3抗体进行蛋白免疫印迹实验。检测TNF-α的表达。结果:(一)原代成骨细胞的形态学观察小鼠颅骨的细小组织块培养24h后,镜下观察:组织块附近可观察到少数细胞游出;继续培养24h后镜下观察:已有部分细胞开始贴壁,且周围发亮,显示其具有活性。以组织块为中心,细胞分布密集处呈铺路石状,胞体膨大,部分细胞胞浆丰富,胞浆伸长,核偏位,突起细长呈平行样或相嵌状排列。细胞形状不规则,多呈三角形及多角形,也有长梭形。(二)ALP法鉴定原代培养细胞采用碱性磷酸酶(ALP)染色所培养细胞。培养的染色细胞,呈块状或灰黑色颗粒状沉淀,胞质为阳性反应。(三)Pg-LPS抑制成骨细胞活性并诱导成骨细胞凋亡1、Pg-LPS对成骨细胞活性的影响:用不同浓度的Pg-LPS作用于成骨细胞并在48h时检测细胞活性,发现当Pg-LPS在浓度为50 ng/mL时活性开始降低,并且在浓度为100 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL时显著降低了成骨细胞的活性(P<0.05);用浓度500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨细胞后,在0、6、12、24、48、72h这6个不同时间点收集成骨细胞进行的实验结果显示:随着作用时间的递增,成骨细胞的活动明显降低(P<0.01)。2、Pg-LPS对成骨细胞凋亡的影响:不同浓度的Pg-LPS作用于成骨细胞并在48h时检测成骨细胞凋亡率,发现Pg-LPS浓度在50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1000ng/mL时成骨细胞凋亡率明显递增(P<0.05),浓度在达到500 ng/mL后递增的趋势减缓趋于平衡;用浓度为500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨细胞后在不同的时间点检测成骨细胞凋亡率,结果显示成骨细胞的凋亡率随着作用时间的增加呈现明显递增趋势,细胞凋亡率与Pg-LPS处理的时间呈正相关性,并且在48h时趋于平衡(P<0.01)。(四)CGRP对Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导成骨细胞凋亡的调控作用1、Pg-LPS对CGRP的调控:Pg-LPS作用于成骨细胞后分别于0、6、12、24、48收集细胞进行实验,最后对CGRP含量数据分析。结果显示:CGRP的表达在6h时出现短暂升高,此后,蛋白质含量逐渐降低,并且随着作用时间的递增,CGRP含量明显下降(P<0.01)。2、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的活性抑制:用不同浓度的CGRP对相同浓度(500ng/ml)Pg-LPS作用下的成骨细胞进行实验。结果显示:CGRP对Pg-LPS有一定的调控作用,当CGRP的浓度为100n M时,CGRP能显著减轻Pg-LPS对成骨细胞活性的抑制(P<0.01)。3、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞凋亡的诱导:本实验用对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS共四个组分别处理成骨细胞后用流式细胞仪检测细胞的凋亡,结果显示100n M的CGRP能够显著减弱Pg-LPS诱导的成骨细胞的凋亡率。这一结果与之前的实验结果是一致的(P<0.05)。4、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的活性的抑制:本实验用对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS四组,作用于成骨细胞后,运用Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3抗体检测细胞凋亡,结果显示:CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的活性的抑制。(五)CGRP对Pg-LPS诱导成骨细胞凋亡过程中TNF-a的表达影响1、Pg-LPS诱导成骨细胞炎症因子的表达:实验分别在0、6、12、24、48h 5个时间点收集细胞,检测TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2炎症因子的表达。结果显示:与对照组比较Pg-LPS促进TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-2的表达,并且呈时间依赖性表达。2、CGRP抑制Pg-LPS对的成骨细胞炎症因子的诱导:本实验检测对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨细胞后,细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2)的表达。结果显示:相同浓度的CGRP作用后只有对TNF-α的生成具有显著的变化,而对IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2没有明显变化。3、CGRP抑制Pg-LPS对成骨细胞TNF-α的诱导:实验将对照组、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨细胞后细胞炎症因子TNF-α表达。结果显示:CGRP抑制Pg-LPS对的成骨细胞TNF-α的诱导。(六)TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中的作用1、TNF-α及CGRP作用于Pg-LPS对成骨细胞的活性影响:实验分别用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨细胞后检测成骨细胞的活性。结果显示:CGRP能够减弱Pg-LPS作用下对成骨细胞的活性抑制,但在有TNF-a存在的情况下,却无法产生抑制作用。可见,TNF-a在Pg-LPS抑制的成骨细胞活性起着一定的作用。2、TNF-α及CGRP作用于Pg-LPS对成骨细胞的凋亡影响:实验分别用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨细胞后检测成骨细胞的凋亡。结果显示:CGRP能够缓解Pg-LPS作用下细胞的凋亡,但在有TNF-a存在的情况下,却无法产生这种诱导作用。这一结果与之前的实验结果是一致的(P<0.05)。3、CGRP减弱Pg-LPS对成骨细胞的凋亡的调控:本实验检测细胞活性表达。结果显示:CGRP能抑制Pg-LPS导致的Cleaved-Caspase 8、Cleaved-Caspase 3蛋白水平的上调,却无法抑制TNF-a、CGRP、Pg-LPS共培养所上调的Cleaved-Caspase 8和Cleaved-Caspase3的表达。表明:CGRP可以抑制Pg-LPS诱发的凋亡,但这种现象却被TNF-a反转了;推测TNF-a很可能就在CGRP抑制Pg-LPS诱导的成骨细胞凋亡作用中扮演着起逆转作用。结论1:Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导成骨细胞凋亡。2:CGRP减弱Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡的作用。3:CGRP抑制Pg-LPS诱导的成骨细胞TNF-α的表达。4:TNF-α在Pg-LPS抑制成骨细胞活性及诱导凋亡中起重要的作用,且可以被CGRP逆转。