链格孢橘致病型（Alternaria alternata tangerine pathotype）,又名柑橘褐斑病菌,由其引起的柑橘褐斑病（Alternaria brown spot,ABS）可为害柑橘嫩梢、嫩叶及果实,常对部分宽皮柑橘生产带来严重问题。随着该菌全基因组测序工作的完成,其生长发育及致病相关基因逐步被挖掘,从而为深入研究其致病分子机理奠定基础。转录因子被证明参与调控多种植物病原真菌的生长发育、对外界胁迫应答反应、致病性、对药物的耐受性和次级代谢产物合成等过程。本研究通过基因敲除及互补,初步分析AaMR1和AaSNF1基因在柑橘褐斑病菌生长发育及致病过程中的作用。将野生型和ΔAamr1-91分别接种红橘离体叶片28 h后,取样进行转录组测序分析,研究转录因子AaMR1基因对柑橘褐斑病菌的生长发育及致病的调控机制,以及对红橘响应柑橘褐斑病菌侵染的转录表达的影响机制。得到如下结果:1、获得AaMR1和AaSNF1基因的敲除突变体和互补菌株。利用Split-marker基因敲除技术和PEG（Polyethylene glycol）介导的原生质遗传转化法,经潮霉素筛选、PCR（Polymerase chain reaction）及Southern blot验证,得到AaMR1和AaSNF1基因敲除菌株。通过酵母同源重组原理构建基因功能互补质粒,转化突变体原生质体,经抗生素博来霉素和PCR筛选,得到互补菌株。2、AaMR1基因参与调控柑橘褐斑病菌的产孢、毒力和黑色素合成。AaMR1基因缺失导致菌落和分生孢子黑色素丧失,分生孢子变短,产孢量显著下降,致病力增强,但不影响菌株的生长、渗透压胁迫和细胞壁功能。利用实时荧光定量PCR,分析野生型和突变体在侵染红橘不同时期AaMR1基因、黑色素合成和毒素合成相关基因的表达情况。结果表明,突变体黑色素合成基因表达显著下调,AaMR1基因表达下调,毒素合成基因ACTTS3显著上调,表明AaMR1基因负调控柑橘褐斑菌的致病力,推测ACTTS3毒素基因表达上调可能是导致AaMR1基因缺失突变体致病性增强的原因之一。3、AaSNF1基因参与柑橘褐斑病菌的生长、产孢、碳源利用、细胞壁完整性及致病性。AaSNF1的缺失影响柑橘褐斑菌的菌丝生长、产孢、碳源利用、细胞壁功能及致病性。突变体孢子变短,产孢量显著下降,孢子萌发速度明显减缓,在不同培养基上生长速度下降;生长速度在不同单一碳源的MM培养基上受到不同程度抑制,尤其在多聚半乳糖醛酸、蔗糖和乙醇培养基上影响较大;突变体对寄主的致病力显著降低。4、AaMR1基因对柑橘褐斑病菌的生长发育、产孢过程、黑色素合成、毒素产生、碳水化合物酶类的产生等方面都具有重要的调控作用。利用转录组测序得到柑橘褐斑病菌野生型菌株Z7及AaMR1突变菌株ΔAamr1-91在营养生长时期及接种红橘状态下的转录表达谱,并筛选其中19个差异表达的基因进行了qRT（Reverse transcriptional）-PCR验证。通过比较野生型菌株Z7在营养生长阶段和侵染寄主阶段的差异基因获得褐斑病菌致病相关的基因,结果显示在侵染红橘过程中MAPK信号、G蛋白信号和双组份信号转导途径富集大量差异基因,这些信号调控真菌的生殖发育和抗逆等多种生命进程。在侵染过程中C代谢途径有大量基因上调表达,其中降解植物细胞壁的水解酶基因家族差异显著,此外还有产生毒素的次级代谢基因簇、抗氧化系统的保护酶、产生效应子的分泌蛋白、调控物质能量平衡的转运蛋白和大量转录调控因子都在侵染过程中大量表达,说明褐斑病菌侵染柑橘是个依赖多种途径调控的复杂过程。比较营养生长条件下转录因子AaMR1敲除后和野生型菌株之间差异,共获得370个差异表达基因,其中在ΔAamr1-91中上调的基因有337个,下调的基因有33个。对差异表达基因进行Gene Ontology（GO）功能富集分析,结果显示在营养生长阶段这些差异基因参与刺激响应、信号转导、细胞膜、核酸绑定及抗氧化活性。AaMR1突变造成黑色素合成相关基因SCD1显著下调表达,与突变体菌株形态上黑色素丧失相一致。通过KEGG分析柑橘褐斑病菌突变菌株ΔAamr1-91与野生型Z7生长发育及致病相关功能及通路的差异表达基因,结果显示,突变造成的表达上调基因富集在MAPK信号通路、色氨酸代谢、氨基酸糖和核酸糖代谢通路。其中AaMR1基因突变造成MAPK信号途径中基因表达上调,同时突变菌株中的水解酶基因表达也显著高于野生型,AaMR1也负调控部分抗氧化基因表达。通过GO富集比较侵染过程中的野生型和突变体之间的差异,分析其对柑橘褐斑病菌的转录调控作用,此处主要关注AaMR1转录因子与存在互作的其它转录因子的转录调控影响情况。GO富集分析显示,注释为核酸绑定的转录因子在接种红橘条件下受AaMR1缺失的影响表达下调,因此在接种红橘的过程中AaMR1正调控转录因子表达,与此相反的是在营养生长阶段突变体和野生型形成的差异基因中,除AaMR1自身突变造成基因表达下调,其它的转录因子在野生型中的表达都高于突变体,因此在营养生长阶段AaMR1负调控转录因子表达,这表明AaMR1在营养生长和红橘侵染过程中的调控模式相反,通过表型可知AaMR1在营养生长阶段正调控黑色素形成,在侵染阶段负调控致病力,推测AaMR1的功能与转录因子之间相互调控相关。5、柑橘褐斑病菌诱导红橘上调的差异表达基因主要富集在病原菌识别、信号转导、活性氧消除、转录调控、次生代谢反应、病程相关蛋白等生物胁迫相关基因类别,AaMR1基因对红橘次级代谢产物、激素及抗性基因/蛋白/转录因子介导的防御机制均产生影响。利用转录组测序获得柑橘褐斑病菌野生型菌株Z7及ΔAamr1-91突变体菌株侵染前后柑橘材料的转录组表达谱,并筛选其中19个差异表达的基因进行了qRT-PCR验证。结果显示,红橘对褐斑病菌野生型和突变体都有剧烈的响应,寄主接种褐斑病菌28 h后产生大量与胁迫相关差异表达基因,通过GO、KEGG富集和MapMan软件注释分析,红橘在受褐斑病菌胁迫的过程中基础代谢被严重破坏,C/N代谢过程有显著的变化,光合作用严重受阻造成物质和能力供应不足,ET/JA（乙烯/茉莉酸）为主的激素信号被诱导以激活下游基因表达,萜类和多酚为代表的次生代谢产物合成相关变化明显产生抗菌物质,受信号转导影响,大量参与抗逆过程的转录因子如WRKY、ERF、MYB、NAC被诱导激活,在转录因子调控下PTI及ETI响应基因如受体激酶,NBS抗病蛋白等也大量表达,同时抗病基因PR和抗氧化保护酶系统相关基因POD等也受褐斑病菌诱导表达。以上结果表明,柑橘褐斑病菌侵染对寄主内部生理状态产生巨大的影响。比较红橘对野生型和ΔAamr1-91突变体菌株之间的响应发现,通过MapMan注释下的激素信号通路中,在ΔAamr1-91侵染下寄主的JA合成途径基因表达都显著低于野生型菌株侵染寄主基因,说明在突变体菌株侵染过程中JA合成及信号转导弱于野生型侵染状态。KEGG代谢通路显示在突变体侵染过程中,柑橘体内苯丙烷类、类黄酮和花青素等次生代谢物质合成相关的途径部分基因低于野生菌株侵染过程,抗坏血酸代谢途径中受突变体菌株侵染后的表达相对低于褐斑病橘野生型菌株Z7侵染,在差异表达基因中也鉴定到24个转录因子,这些转录因子以表达为主,同样下调的还有16个受体激酶蛋白。由于菌株AaMR1敲除后侵染红橘相对野生型病情加剧,转录表达显示介导柑橘防御相关的激素合成途径相关基因、次级代谢产物合成代谢途径相关基因及重要的抗性相关基因及蛋白的表达均受到不同程度影响,防御相关基因主要表现为下调趋势。因此,ΔAamr1-91与野生型侵染激发的寄主抗性相比,突变菌株抑制寄主体内受体激酶的表达或者抑制JA信号而影响下游抗病基因表达,导致寄主抗性相对较弱,该结果也与AaMR1主要对菌株的毒力起负调控作用的结果一致。