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肿瘤免疫治疗是治疗恶性肿瘤的有效手段,在肿瘤治疗中具有独特优势。其中,肿瘤纳米疫苗利用肿瘤特异性抗原激活抗原提呈细胞(Antigen presenting cells,APCs),启动抗原特异性免疫反应,抑制和杀伤肿瘤细胞,是肿瘤免疫治疗中最具应用前景的治疗手段之一。受主要组织相容性复合物I(Major histocompatibility complex I,MHC I)分子抗原呈递不强的影响,纳米疫苗的肿瘤免疫治疗疗效差。本文致力于设计新型糖脂纳米疫苗,通过靶向树突状细胞(Dendritic cells,DCs),以及促进抗原的溶酶体逃逸,增强MHC I分子抗原呈递,提高肿瘤免疫治疗疗效。通过酰胺反应将壳聚糖(Chitosan,Ct)嫁接至硬脂酸(Stearic acid,SA),得到糖脂嫁接物壳聚糖-硬脂酸(Stearic acid-grafted chitosan,CtSA)。DCs是抗原提呈能力最强的APCs,且高表达甘露糖受体。将甘露糖(Mannose)嫁接至CtSA,得到甘露糖修饰壳聚糖-硬脂酸(Mannose modified stearic acid-grafted chitosan,MCtSA)。体外细胞摄取实验结果表明,甘露糖的靶向修饰,可促进DCs对MCtSA胶束的摄取。皮肤组织富含DCs,DCs表面趋化因子受体7(Chemokine receptor type7,CCR7)表达少,限制了皮肤DCs的淋巴结迁移,MHC I分子抗原呈递受限,导致抗肿瘤免疫效应弱。以MCtSA为抗原卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)及编码CCR7质粒DNA(pDNA)的靶向递送载体,构建MCtSA/OVA/pDNA糖脂纳米疫苗,通过载体甘露糖修饰靶向皮肤DCs,经DCs内pDNA的释放提高CCR7的表达,促进皮肤DCs向淋巴结迁移,经质子化效应促进OVA的溶酶体逃逸,增强MHC I分子抗原呈递,达到高效治疗肿瘤的目的。经测定,MCtSA/OVA/pDNA粒径为184.3±3.21 nm,表面电位为9.14±0.35mV。体外细胞实验结果显示,pDNA及OVA均可实现溶酶体逃逸,MCtSA/OVA/pDNA可明显上调DCs共刺激分子CD40、CD86的表达及细胞因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的分泌,促进DCs的激活与成熟,且MCtSA/OVA/pDNA对DCs无明显细胞毒性作用。同时,MCtSA/OVA/pDNA上调CCR7及运动相关蛋白RAC1的表达,增强DCs的迁移能力。模型动物实验结果显示,MCtSA/OVA/pDNA具有抗原储库效应,可靶向并被皮肤DCs摄取,明显促进皮肤DCs向淋巴结的迁移,诱导较强的CD8~+T细胞免疫反应,明显抑制肿瘤生长。与OVA相比,MCtSA/OVA/pDNA的肿瘤抑制率明显提高。淋巴结含有大量DCs,是肿瘤靶向免疫治疗的重要靶点。其中,肿瘤引流淋巴结(Tumor-draining lymph node,TDLN)含有较多肿瘤抗原。将免疫佐剂靶向递送至TDLN,可实现针对个体的有效免疫治疗。以MCtSA为免疫佐剂及抗原捕获剂,靶向TDLN并捕获TDLN内源性肿瘤抗原,促进TDLN内DCs的抗原摄取及DCs内抗原的溶酶体逃逸,增强MHC I分子抗原呈递,提高免疫治疗疗效。MCtSA的粒径为94.2±0.60 nm,表面电位为11.8±1.25 mV;MCtSA模拟抗原捕获,与抗原OVA混合,混合液(MCtSA+OVA)粒径为126.0±3.46 nm,表面电位为6.75±0.40 mV。与MCtSA相比,MCtSA+OVA粒径明显增加,表面电位明显降低,表明MCtSA可捕获抗原。定量测定结果显示,MCtSA的抗原捕获量为308.6μg/mg,且MCtSA通过捕获抗原,可明显促进DCs的抗原摄取,表明MCtSA具有较强的抗原捕获能力。细胞摄取实验结果显示,MCtSA上调DCs共刺激分子CD40、CD86的表达,促进细胞因子TNF-α、IL-6的分泌,具有较强免疫佐剂活性,且MCtSA对DCs无明显细胞毒性作用。模型动物实验结果显示,MCtSA具有TDLN靶向性,可被TDLN内的DCs摄取,促进DCs的激活与成熟,诱导较强的CD4~+T及CD8~+T细胞免疫反应,促进机体分泌细胞因子干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、TNF-α、白介素-12(Interleukin-12,IL-12)、IL-6,明显抑制肿瘤的生长,肿瘤抑制率达到71.5%。直接将抗原靶向递送至淋巴结DCs是纳米疫苗实现有效肿瘤免疫治疗的重要策略。通过控制纳米疫苗的粒径和表面电位,可将纳米疫苗直接转运至淋巴结,进一步靶向淋巴结DCs。以组氨酸修饰壳聚糖-硬脂酸(Histidine modified stearic acid-grafted chitosan,HCtSA)为抗原递送载体,进一步用DCs细胞膜(Dendritic cell membrane,DCM)包被,构建DCM/HCtSA/OVA糖脂纳米疫苗,以DCM包被靶向淋巴结、促进DCs抗原摄取,组氨酸修饰增强OVA溶酶体逃逸,促进MHC I分子抗原呈递,诱导较强抗肿瘤免疫效应。经测定,DCM/HCtSA/OVA的粒径为149.9±7.85 nm,表面电位为-5.63±0.31mV。DCM/HCtSA/OVA的体外抗原释放动力学研究结果显示,分别以pH 7.4和pH5.0的PBS为释放介质,OVA的24 h累积释放百分率,分别为52.9%和76.4%,表明OVA具有酸性环境敏感释放特性。体外细胞摄取实验结果显示,DCM/HCtSA/OVA可促进DCs的抗原摄取,实现OVA的溶酶体逃逸,明显上调DCs的CD40、CD86表达及TNF-α、IL-6分泌。模型动物实验结果显示,DCM/HCtSA/OVA可靶向淋巴结DCs,促进淋巴结DCs的抗原摄取,以及淋巴结DCs的激活与成熟,诱导较强的CD4~+T及CD8~+T细胞免疫反应,促进机体分泌IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6。DCM/HCtSA/OVA的肿瘤抑制率为85.8%,显著高于OVA对照的39.5%,表明DCM/HCtSA/OVA可明显抑制肿瘤的生长。