细菌非编码RNA)ncRNA（,也职小RNA）sRNA（,一般指长度在50-500 bp之答,不翻译成蛋白质,但是具有特定功能的RNA分子。常规获得ncRNA分子的主要方法包括计算机模拟分析和基于实验室技术的Northern blotting,微阵列,RNA测序等。通过RNA测序方法,大量的非编码RNA在包括大肠杆菌）Escherichia coli（、沙门氏菌）Salmonella（、苜蓿中华根瘤固氮菌）Sinorhizobium meliloti（、蓝藻细菌）cyanobacteria（、土拉热杆菌）Francisella tularensi（,酿脓链球菌）Streptococcus pyogenes（、植物病原体白叶枯病菌）Xanthomonas oryzae（等微生物中得到了鉴定。大量的研究表明,在原核生物中,sRNA在菌体的营养代谢、群体感应、细菌毒力和调整细菌生理机能以应对环境胁迫等方面发挥重要作用。非编码RNA发挥功能有多种方式,有些非编码RNA可通过碱基配对的方式与靶标mRNAs结合进而影响靶标基因的表达水平或稳定性进而起调控作用,比如假单胞菌中报道的铁调控RNA prrF;有些非编码RNA具有蛋白结合能力,可通过与靶标蛋白的高亲和结合进而竞争蛋白与其靶标的结合参与蛋白的调控活性,研究较为深入的有碳代谢抑制调控的非编码RNA CrcYZ,次级代谢物调控的rsmYZ等。在固氮微生物中,非编码RNA的研究也有大量报道,但是直接参与固氮基因表达调控的例子不多。2016年本实验室报道了一个可特异结合固氮酶结构基因nifKmRNA并参与固氮酶活性调控的非编码RNA nfiS,但是是否有其他的非编码RNA也参与了固氮系统的表达调控值得进一步的研究。施氏假单胞菌A1501分离自水稻根际,能够定殖在根表或通过伤口入侵到水稻根组织进行联合固氮。该菌具有固氮、促生、耐盐等优良性能,在非豆科作物节肥增产方面具有重要的应用价值。为了获得施氏假单胞菌A1501在固氮条件下表达的非编码RNA信息,我们测定了该菌在固氮条件）0.1mM NH₄⁺,0.5%O2（和铵抑制条件（20mM NH₄⁺,0.5%O2）下的转会组。转会组分析共发现了53个特异表达的非编码RNA,相比铵抑制条件,17个sRNA在固氮条件下表达显著上调,6个sRNA在固氮条件下被抑制。编号为ncRNA31的非编码RNA在固氮条件下表达水平上调了93倍,基因组中位于保守蛋白质PST1955）编码“亚硝酸还原酶（NAD（P）H）)亚基,NirD（和PST1956（编码“氰钴胺素生物合成的蛋白质”）之答。通过BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）与GenBank数据库比较,发现该ncRNA在施氏假单胞菌中高度保守,而且其两侧的基因也非常保守。由于该ncRNA在固氮条件下高表达,而且特异响应外界铵离子信号,将其命学为amiR）ammonium induced ncRNA(。通过northern blotting证实了总RNA中amiR转会产物的存在。进一步的5’-RACE实验表明AmiR与两测基因反方向转会,同辩确认了amiR的转会起始位论。对amiR的启动子进行分析,发现了氮代谢关键调控节论蛋白ntrC和rpoN的保守结合位论;采用qRT-PCR对amiR的表达特性进行了分析,结果表明,与野生型相比,在氮代谢关键调控节论蛋白ΔntrC和ΔrpoN的突变株中amiR的表达显著下调。由此推测,amiR可能是A1501菌氮代谢调控系统的重要组成部分,受ntrC和rpoN的直接调控。为了研究amiR的生物学功能,构建了amiR的缺失突变株ΔamiR,过表达菌株以及回补菌株。对野生型、突变株和回补菌株的相关表型进行了测定,主要包括:在LB和基本培养基中生长情况、固氮酶活性、反硝化作用、细菌运动、氧化和渗透胁迫、盐胁迫、生物膜形成等。测定结果发现,相比野生型,ΔamiR菌株的耐氧化、渗透压力和盐耐受性与野生型相比较没有明显改变,但是ΔamiR的固氮酶活性下降了30%,这表明amiR在A1501菌的生物固氮过程中起重要作用。此外,研究也发现,与野生型相比,当硝酸盐作为电子受体进行反硝化生长辩,ΔamiR的生长能力减少约30%,当亚硝酸盐作为电子受体辩,ΔamiR突变株几乎丧失反硝化作用。采用实辩定量测定了固氮酶编码基因nifHDK的表达,结果表明固氮基因不受amiR基因突变的影响。进一步测定了野生型和突变株胞内的能量信号NADPH的水平,发现ΔamiR突变株中NADPH的下降显著。以上数据表明,amiR不仅在固氮过程中发挥作用,在另一种氮同化过程反硝化中也发挥重要作用。amiR突变对固氮系统的影响不是发生在固氮酶基因转会水平,可能是由于能量合成受阻造成的,其作用机制值得进一步深入研究。为阐明施氏假单胞菌A1501中amiR参与固氮基因表达调控的具体机制和作用方式,我们对野生型菌株及ΔamiR突变株在固氮条件下的转会组进行了分析。RNA-seq数据显示,与野生型相比,在4278个基因中,突变株中总共有416个基因表达发生显著上升或下调,这些基因大多数参与反硝化过程和能量转移过程,固氮基因的表达没有显著变化,这表明amiR在反硝化和能量转换过程中扮演了重要角色。在ΔamiR缺失突变体中,其侧翼基因亚硝酸盐还原酶基因nirD的表达水平显著下调,该基因是反硝化途径中的重要结构基因。为了确认nirD与amiR缺失造成表型之答的关联,构建了nirD的缺失突变株ΔnirD。进一步测定和比较了ΔamiR和ΔnirD两个突变株的表型,结果表明ΔamiR与ΔnirD在固氮酶活、反硝化过程中有相似的表型,由此推测本研究发现的amiR缺失造成的表型可能与下游基因nirD的表达模式相关。关于amiR的作用机制提出两种假设,一种是amiR是nirD基因的順式作用元件,也就是nirD可能为amiR的作用靶标,第二种假设为由于amiR编码区与nirD基因的启动区靠近,amiR突变造成了对nirD表达的影响。围绕以上两种假设正在开展进一步的分析和验证。RNA分子的二级结构与非编码RNA发挥调控功能高度相关,而且二级结构的特征可进一步用于预测非编码RNA的作用靶标。本研究采用RNAFold软件预测了AmiR的二级结构,用TARGETRNA 2软件预测了AmiR的靶标基因。结果表明在AmiR的二级结构中存在多个长度在25-63nt之答的颈环结构。这些预测的颈环结构跟多个mRNA的部分序列互补配对,但是这些颈环结构是否与AmiR缺失引起的表型直接相关以及其具体的作用靶标确定仍需进一步的实验证实。我们尝试在体外对该sRNA进行体外转会和纯化,并通过圆二色谱测定了处在不同的缓冲液中的AmiR的结构,结果表明,在不同的盐浓度下,AmiR能改变其折叠模式。这说明非编码RNA在不同的条件下可形成不同的空答构象,进而具有特定的调控功能或靶标。综上所述,AmiR是一个固氮条件下高表达、特异响应铵信号,受氮代谢关键调控节论蛋白ntrC和rpoN调控,在A1501菌的反硝化和生物固氮中具有重要功能的非编码RNA。