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第一部分人精浆中低叶酸状态对精子DNA甲基化的影响
【目的】本研究检测了105名男性不育患者的精浆叶酸浓度和精液参数，通过分析发现他们精浆中的叶酸浓度与精子DFI呈负相关。叶酸的代谢产物SAM可为DNA甲基化提供甲基供体，叶酸缺乏时会影响到基因组DNA的甲基化，因此人体长期的叶酸缺乏也能影响到精子基因组DNA的甲基化。本部分的目的是研究精浆中低叶酸人群精子基因组DNA甲基化的变化，并探究精浆中叶酸浓度与精子DFI呈负相关的潜在机制。
【方法】本研究选取8名精浆叶酸浓度正常的受试者分一组，8名精浆中叶酸浓度低的分为一组，所选患者两组年龄、体重指数(BMI)无差别，精浆中的叶酸浓度分别为[26.56(25.58-31.43)nmol/L](25%-75%)和[12.9(11.45-15.12)nmol/L](0-25%)。用ReducedRepresentationBisulfiteSequencing(RRBS)技术对精子全基因组进行甲基化检测，再通过生物信息学分析差异的DNA甲基化区域。
【结果】通过对两组的甲基化测序结果进行生物信息学分析，一共发现显著差异的DNA甲基化区域有8个，涉及到神经发育，DNA断裂修复、RNA合成通路等。其中DNA双键断裂(DNA double breaks,DSB)修复通路相关的DNARepairAnd
RecombinationProteinRAD54(Rad54)基因甲基化水平在低叶酸组明显高于正常组。【结论】叶酸缺乏会影响到精子基因组的甲基化，使一些基因的甲基化水平增加，一些基因的甲基化水平降低，这些基因可能涉及到重要的生命过程，如DNA双链断裂损伤修复通路相关基因Rad54。
第二部分叶酸缺乏引起的Rad54基因启动子区甲基化异常导致精子DNA损伤的机制研究
【目的】精子DNA损伤是男性不育的常见原因之一，多种原因可导致精子DNA损伤。体内叶酸缺乏可使Rad54基因启动子区甲基化水平增加，Rad54基因是DSB修复通路相关的重要基因，其表达异常使得精子发生过程中对外界损伤刺激的敏感性增加，精子DFI增加。本部分的目的是初步研究叶酸缺乏导致的Rad54基因甲基化异常影响到DSB修复通路，进而导致精子DNA损伤增加的机制。
【方法】为了研究叶酸缺乏导致精子DNA损伤的机制，本研究分别设计动物实验和细胞实验进行验证。动物实验部分，将正常8周龄C57雌雄小鼠随机分成3组，每组雌雄各8只，3组雌鼠分别用低叶酸(叶酸浓度0.3mg/kg)的饲料、正常饲料(叶酸浓度2mg/kg)和高叶酸(叶酸浓度20mg/kg)的饲料喂养2周，然后与正常饲料喂养的雄性小鼠合笼，合笼后各组喂养条件不变。F1代8周时分别检测小鼠血清叶酸浓度，确定模型是否构建成功；分别检测各组F1代雄鼠附睾精液参数，用精子染色体结构分析(sperm chromatin structure analysis,SCSA)法检测精子DNA碎片化指数(DNA fragmentation index,DFI)，确定DNA损伤情况；提取精子DNA，用重亚硫酸测序(Bisulfite sequencing,BSP)法检测Rad54基因启动子区甲基化水平；用蛋白质印记(Western blot,WB)和免疫荧光法分别检测各组小鼠睾丸中Rad54蛋白和γ-H2AX蛋白的表达；F1代雄鼠与正常雌鼠交配，统计F1代生育后代情况。细胞实验部分，分别用无叶酸培养基、叶酸浓度分别为4ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的培养基构建GC-2细胞模型，提取细胞基因组DNA、总蛋白和总RNA，用亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法检测各组Rad54基因启动子区甲基化水平；WB和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Rad54和γ-H2AX的表达水平；做细胞爬片，并用5mmol/L的H2O2处理10min后，用免疫荧光方法检测各组对外界损伤刺激的敏感性。
【结果】动物实验部分，检测8周龄F1代雄鼠血清叶酸浓度，低叶酸组明显低于正常组和叶酸补充组，低叶酸组小鼠精子浓度、精子活力低于正常组和叶酸补充组，免疫荧光和WB结果可以看出低叶酸组Rad54表达低于正常组和叶酸补充组，低叶酸组γ-H2AX的表达高于正常组和叶酸补充组，低叶酸组精子DFI明显高于正常组和叶酸补充组，低叶酸组Rad54基因启动子区甲基化水平高于正常组和叶酸补充组。细胞实验部分，从WB、免疫荧光及RT-PCR结果中可以看出，Rad54的表达在无叶酸组明显低于4ng/ml、20ng/ml、200ng/ml叶酸组，DNA双键断裂标志性蛋白γ-H2AX在无叶酸组明显高于4ng/ml、20ng/ml、200ng/ml叶酸组，Rad54基因启动子区甲基化水平在无叶酸组明显增高。
【结论】叶酸缺乏可以使DNA双建断裂修复(DNA double-bond rupture,DSB)通路相关基因Rad54启动子区甲基化水平增加，使Rad54蛋白的表达降低，使DSB修复通路受到影响，在精子发生的过程中更易受到外界损伤刺激的影响，使成熟精子DFI增加。
【目的】本研究检测了105名男性不育患者的精浆叶酸浓度和精液参数，通过分析发现他们精浆中的叶酸浓度与精子DFI呈负相关。叶酸的代谢产物SAM可为DNA甲基化提供甲基供体，叶酸缺乏时会影响到基因组DNA的甲基化，因此人体长期的叶酸缺乏也能影响到精子基因组DNA的甲基化。本部分的目的是研究精浆中低叶酸人群精子基因组DNA甲基化的变化，并探究精浆中叶酸浓度与精子DFI呈负相关的潜在机制。
【方法】本研究选取8名精浆叶酸浓度正常的受试者分一组，8名精浆中叶酸浓度低的分为一组，所选患者两组年龄、体重指数(BMI)无差别，精浆中的叶酸浓度分别为[26.56(25.58-31.43)nmol/L](25%-75%)和[12.9(11.45-15.12)nmol/L](0-25%)。用ReducedRepresentationBisulfiteSequencing(RRBS)技术对精子全基因组进行甲基化检测，再通过生物信息学分析差异的DNA甲基化区域。
【结果】通过对两组的甲基化测序结果进行生物信息学分析，一共发现显著差异的DNA甲基化区域有8个，涉及到神经发育，DNA断裂修复、RNA合成通路等。其中DNA双键断裂(DNA double breaks,DSB)修复通路相关的DNARepairAnd
RecombinationProteinRAD54(Rad54)基因甲基化水平在低叶酸组明显高于正常组。【结论】叶酸缺乏会影响到精子基因组的甲基化，使一些基因的甲基化水平增加，一些基因的甲基化水平降低，这些基因可能涉及到重要的生命过程，如DNA双链断裂损伤修复通路相关基因Rad54。
第二部分叶酸缺乏引起的Rad54基因启动子区甲基化异常导致精子DNA损伤的机制研究
【目的】精子DNA损伤是男性不育的常见原因之一，多种原因可导致精子DNA损伤。体内叶酸缺乏可使Rad54基因启动子区甲基化水平增加，Rad54基因是DSB修复通路相关的重要基因，其表达异常使得精子发生过程中对外界损伤刺激的敏感性增加，精子DFI增加。本部分的目的是初步研究叶酸缺乏导致的Rad54基因甲基化异常影响到DSB修复通路，进而导致精子DNA损伤增加的机制。
【方法】为了研究叶酸缺乏导致精子DNA损伤的机制，本研究分别设计动物实验和细胞实验进行验证。动物实验部分，将正常8周龄C57雌雄小鼠随机分成3组，每组雌雄各8只，3组雌鼠分别用低叶酸(叶酸浓度0.3mg/kg)的饲料、正常饲料(叶酸浓度2mg/kg)和高叶酸(叶酸浓度20mg/kg)的饲料喂养2周，然后与正常饲料喂养的雄性小鼠合笼，合笼后各组喂养条件不变。F1代8周时分别检测小鼠血清叶酸浓度，确定模型是否构建成功；分别检测各组F1代雄鼠附睾精液参数，用精子染色体结构分析(sperm chromatin structure analysis,SCSA)法检测精子DNA碎片化指数(DNA fragmentation index,DFI)，确定DNA损伤情况；提取精子DNA，用重亚硫酸测序(Bisulfite sequencing,BSP)法检测Rad54基因启动子区甲基化水平；用蛋白质印记(Western blot,WB)和免疫荧光法分别检测各组小鼠睾丸中Rad54蛋白和γ-H2AX蛋白的表达；F1代雄鼠与正常雌鼠交配，统计F1代生育后代情况。细胞实验部分，分别用无叶酸培养基、叶酸浓度分别为4ng/ml、20ng/ml、200ng/ml的培养基构建GC-2细胞模型，提取细胞基因组DNA、总蛋白和总RNA，用亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法检测各组Rad54基因启动子区甲基化水平；WB和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Rad54和γ-H2AX的表达水平；做细胞爬片，并用5mmol/L的H2O2处理10min后，用免疫荧光方法检测各组对外界损伤刺激的敏感性。
【结果】动物实验部分，检测8周龄F1代雄鼠血清叶酸浓度，低叶酸组明显低于正常组和叶酸补充组，低叶酸组小鼠精子浓度、精子活力低于正常组和叶酸补充组，免疫荧光和WB结果可以看出低叶酸组Rad54表达低于正常组和叶酸补充组，低叶酸组γ-H2AX的表达高于正常组和叶酸补充组，低叶酸组精子DFI明显高于正常组和叶酸补充组，低叶酸组Rad54基因启动子区甲基化水平高于正常组和叶酸补充组。细胞实验部分，从WB、免疫荧光及RT-PCR结果中可以看出，Rad54的表达在无叶酸组明显低于4ng/ml、20ng/ml、200ng/ml叶酸组，DNA双键断裂标志性蛋白γ-H2AX在无叶酸组明显高于4ng/ml、20ng/ml、200ng/ml叶酸组，Rad54基因启动子区甲基化水平在无叶酸组明显增高。
【结论】叶酸缺乏可以使DNA双建断裂修复(DNA double-bond rupture,DSB)通路相关基因Rad54启动子区甲基化水平增加，使Rad54蛋白的表达降低，使DSB修复通路受到影响，在精子发生的过程中更易受到外界损伤刺激的影响，使成熟精子DFI增加。