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柱花草(Stylosanthes spp.)是一种热带地区具有重要经济价值的豆科牧草,具有恢复土壤肥力,改善土壤物理性质,适应酸性土壤生长等特性。然而,柱花草不耐寒,易感染炭疽病,易受重金属协迫等限制因素严重制约了柱花草在生产上的推广。分子遗传改良是解决上述问题的一个重要手段,本文旨在建立柱花草高效遗传转化体系,为其分子育种提供基础。本项目以热研5号柱花草(Stylosanthes guianensis cv.Reyan No.5)为材料,讨论了外植体的选择(下胚轴、子叶以及生长点)、农杆菌菌液浓度(OD600=0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)、浸染时间(5、10、15、20、25 分钟)、共培养时间(1、2、3、4、5天)、乙酰丁香酮浓度(0、50、100、200、400μmol/L)和潮霉素浓度(10、15、20、25 mg/L)对转化愈伤效率的影响,通过GUS染色技术对转化效率进行统计。其结果如下:柱花草对潮霉素(Hyg)较敏感,未经农杆菌浸染的柱花草外植体在Hyg浓度为15 mg/L时,愈伤诱导率仅为9%;当Hyg浓度达17.5 mg/L时外植体几乎褐变死亡。经农杆菌介导的外植体在Hyg浓度为15 mg/L筛选培养后转化愈伤的效率高达71%,故选择Hyg浓度为15 mg/L作为抗性愈伤以及抗性苗筛选培养的最佳浓度。农杆菌菌液浓度对转化效率有显著影响,当农杆菌菌液浓度为OD600=0.6,转化愈伤效率为67%;浸染时间对转化效率有显著影响,当浸染时间为15 min,转化愈伤效率为59%;在共培养基中添加乙酰丁香酮对转化效率有显著影响,当乙酰丁香酮浓度达200 μmol/L,转化愈伤效率为18%;共培养时间对转化效率有显著影响,当共培养时间为3d,转化愈伤的效率为69%。结果表明,选择子叶为外植体,农杆菌菌液浓度(OD600)为0.6,农杆菌浸染时间为15min,乙酰丁香酮浓度为2000μmol/L和共培养时间为3d,该组合可获得较高的转化效率。对利用上述转化体系获得的抗性愈伤以及抗性试管小苗进行GUS检测以及PCR检测。检测结果表明抗性愈伤及抗性试管小苗GUS染色均能观察到蓝色斑点,以抗性愈伤和抗性试管小苗cDNA为模板进行PCR检测,产物电泳后均有目标条带出现。此结果初步说明GUS基因和Hyg基因已转入柱花草中。