肥胖是导致2型糖尿病胰岛素抵抗的重要病理基础。研究表明肥胖患者血清中miR-27a含量显著高于正常体重人群,且与空腹血糖呈正相关。脂肪组织是肥胖状态下循环系统升高的miRNA主要来源,且主要以外泌体形式分泌,发挥生物学活性。而mi R-27a高表达于脂肪组织,且被认为能够通过抑制PPARγ进而抑制脂肪细胞的分化与脂质生成。此外,miR-27a已被证实能够以外泌体形式被乳腺癌细胞所分泌。骨骼肌是外周葡萄糖摄取的主要效应器官,而PPARγ是骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键信号分子IRS-1和GLUT4的核转录因子。因此我们推测,肥胖状态下血清中升高的miR-27a可能是脂肪细胞以外泌体形式所分泌,进而通过抑制骨骼肌组织PPARγ,诱导骨骼肌胰岛素抵抗。本研究通过收集临床肥胖儿童血清、高脂饮食喂养建立C57BL/6J肥胖小鼠模型及慢病毒干预miR-27a沉默小鼠模型、db/db小鼠模型、骨骼肌细胞过表达miR-27a模型、棕榈酸处理的脂肪细胞及脂肪细胞mi R-27a沉默上清液共孵育的骨骼肌细胞模型,明确miR-27a与肥胖胰岛素抵抗相关性,探讨miR-27a通过抑制PPARγ调控骨骼肌胰岛素的作用机制,阐明肥胖状态下,脂肪源性含miR-27a外泌体诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制,揭示mi R-27a在肥胖诱导胰岛素抵抗中的关键作用。本论文研究内容包括三个部分。第一部分探讨miR-27a是否参与调控肥胖胰岛素抵抗。本实验部分通过收集临床肥胖儿童血清、高脂饮食喂养建立C57BL/6J肥胖小鼠模型及慢病毒干预miR-27a沉默小鼠模型、db/db小鼠模型,检测血清miR-27a、血糖、胰岛素、糖耐量、胰岛素耐量等水平,观察骨骼肌miR-27a和IRS-1/Akt/GLUT4糖摄取信号通路蛋白表达,结果显示肥胖儿童血清miR-27a与肥胖程度、空腹血糖、Visfatin、TNF-α和IL-6等促炎因子呈正相关;肥胖小鼠血清和骨骼肌miR-27a水平随高脂喂养时程呈进行性升高,并与全身胰岛素耐量异常水平、糖耐量异常水平和骨骼肌胰岛素抵抗水平趋势一致;肥胖小鼠沉默miR-27a后,胰岛素耐量异常、糖耐量异常和骨骼肌胰岛素抵抗程度均有所恢复;肥胖小鼠骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键因子IRS-1和GLUT4表达显著降低,而沉默mi R-27a后,IRS-1和GLUT4表达有所恢复。结果表明血清和骨骼肌中miR-27a随肥胖进程而增加,且升高的mi R-27a参与调控肥胖胰岛素抵抗。第二部分探讨miR-27a通过抑制PPARγ诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。本实验部分检测了肥胖小鼠模型及慢病毒干预miR-27a沉默小鼠模型中PPARγ表达,并在C2C12小鼠骨骼肌细胞过表达mi R-27a并联合PPARγ激活剂罗格列酮,检测骨骼肌细胞糖消耗、糖摄取及葡萄糖摄取信号通路的变化。结果显示,肥胖小鼠骨骼肌PPARγ表达显著降低,而miR-27a沉默后,肥胖小鼠骨骼肌PPARγ表达有所升高;C2C12骨骼肌细胞过表达miR-27a后,PPARγ表达显著下降,骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键信号分子IRS-1和GLUT4表达显著下降,且胰岛素刺激下的p-IRS-1和p-Akt蛋白激活能力显著下降,细胞糖消耗、糖摄取能力显著下降,;C2C12骨骼肌细胞过表达mi R-27a并联合应用PPARγ激活剂罗格列酮后,PPARγ表达显著上调,骨骼肌葡萄糖摄取信号通路关键信号分子IRS-1和GLUT4表达显著上调,且胰岛素刺激下的p-IRS-1和p-Akt的蛋白激活能力有所上调,细胞糖消耗、糖摄取能力显著上调。以上结果说明肥胖状态下,骨骼肌miR-27a表达显著升高,且过表达的miR-27a能够引起骨骼肌细胞胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过抑制PPARγ。第三部分探讨脂肪源性的含mi R-27a外泌体能否通过抑制PPARγ诱导骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。本部分实验首先在肥胖小鼠模型和棕榈酸处理的脂肪细胞模型中,检测脂肪组织和细胞miR-27a含量,并检验血清和上清液内miR-27a和FABP4含量变化,进一步提取血清和细胞上清液外泌体,扫描电镜和CD63进行外泌体鉴定,免疫荧光检测血清外泌体和FABP4及上清液内miR-27a和FABP4,验证脂肪细胞能够分泌含miR-27a外泌体。结果显示,肥胖小鼠从4w喂养后,脂肪组织miR-27a表达显著降低,肥胖小鼠血清和棕榈酸处理过的脂肪细胞上清液FABP4显著升高,肥胖小鼠血清外泌体呈FABP4阳性表达,且脂肪细胞外泌体呈miR-27a阳性共表达,并能够被骨骼肌细胞摄取,说明肥胖状态下,脂肪细胞能够分泌含miR-27a外泌体。本部分接下来检测肥胖小鼠骨骼肌FABP4含量,并利用棕榈酸处理的脂肪细胞上清液构建条件培养基孵育骨骼肌细胞,进一步沉默脂肪细胞内的miR-27a,并将沉默miR-27a后的脂肪细胞上清液构建条件培养基孵育骨骼肌细胞,检测孵育前后上清液FABP4和miR-27a含量,骨骼肌细胞FABP4和miR-27a含量,荧光标记外泌体后的骨骼肌摄取,及孵育48 h后,骨骼肌细胞糖消耗、糖摄取、PPARγ和葡萄糖摄取信号通路的变化,验证脂肪源性含miR-27a外泌体能够被骨骼肌摄取,并探讨其影响骨骼肌胰岛素抵抗的作用机制。结果显示,肥胖小鼠骨骼肌及棕榈酸处理过的脂肪细胞上清液孵育后的骨骼肌细胞内FABP4含量显著升高,且孵育后上清液内的FABP4和miR-27a含量显著下降,棕榈酸处理过的脂肪miR-27a沉默细胞上清液孵育的骨骼肌细胞内miR-27a相较于棕榈酸未处理组无显著变化,棕榈酸处理过的脂肪细胞上清液孵育后的骨骼肌细胞糖消耗、糖摄取能力显著下降,PPARγ表达显著降低,且葡萄糖摄取信号通路关键分子IRS-1和GLUT4显著降低,且胰岛素刺激下的p-IRS-1和p-Akt的蛋白激活能力显著降低,而给予脂肪细胞miR-27a沉默后,上述指标均有所改善。结果表明,脂肪源性含miR-27a外泌体能够被骨骼肌摄取并诱导骨骼肌胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过miR-27a抑制PPARγ。因此,本课题阐明了1.MiR-27a在肥胖诱导的骨骼肌胰岛素抵抗中发挥重要作用;2.MiR-27a能够由脂质过度堆积的脂肪细胞以外泌体形式分泌,且能够被骨骼肌细胞所摄取;3.脂肪细胞以外泌体形式分泌的mi R-27a能够引起骨骼肌胰岛素抵抗,其潜在机制可能是通过mi R-27a抑制靶基因PPARγ引起骨骼肌葡萄糖摄取受损。本实验为脂肪组织与骨骼肌组织在肥胖模型中的交叉对话提供了新机制,为肥胖治疗、药物干预提供新靶点。