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背景:视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)是位于神经视网膜与Bruch膜之间的单层细胞,具有吞噬感光细胞外节、分泌营养因子、参与视循环代谢和形成血—视网膜屏障等功能,对于维持视网膜正常生理功能十分重要。视网膜色素上皮细胞功能受损将导致包括老年性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt’s综合征等致盲性疾病。目前这类疾病尚缺乏有效治疗措施,RPE移植有望替代患者受损的RPE,从而保护感光细胞,是目前最有前景的治疗措施。RPE种子细胞的来源是制约RPE移植临床转化的重要因素。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力,同时细胞性状稳定,可用于大规模标准化生产RPE细胞,十分适合于临床应用。目前,ESC经自然分化法诱导而来的RPE细胞(SD-RPE)已进入临床试验阶段。三维培养是一种全新的ESC诱导分化技术,已有研究在体外将ESC三维培养分化为视杯样结构,该方法较好地模拟了视网膜的体内发育过程,有望获得更接近于体内正常RPE的种子细胞。RPE细胞的移植方式也影响着其在体内的存活与功能发挥。目前主要包括两种移植方式:细胞悬液移植及细胞片移植。虽然细胞悬液移植手术操作较简单,但植入的种子细胞有聚集成团,难以形成有极性单层细胞的问题,不利于RPE细胞在视网膜内的功能发挥。细胞片移植可维持RPE种子细胞在视网膜内的单层、极性结构,有望提高RPE移植后的效果。组织工程化RPE复合体是将RPE细胞体外培养在生物材料上,形成有极性的、有功能的单层RPE细胞片后,再将生物材料与RPE细胞片的复合物移植到视网膜下腔。如今已有多种生物材料被用于构建组织工程化RPE复合体,来模拟RPE-Bruch膜复合体,但理想的生物材料需同时兼顾生物相容性、可降解性、手术可操作性以及适合RPE细胞的贴壁、生长等因素。目的:研究ESC经三维培养分化而来的RPE细胞(3D-RPE)的生物学特性,获得最优的RPE种子细胞;探讨生物材料对于RPE细胞的生物相容性,制备具有良好生物相容性的生物材料,并模拟RPE-Bruch膜复合体构建组织工程化RPE,研究该复合体生物学特性以及移植后对于视网膜变性的挽救作用。方法与结果:本研究分为三个部分:第一部分:人胚胎干细胞经三维培养法诱导的视网膜色素上皮细胞的细胞生物学特性研究1、研究3d-rpe细胞在分化不同时间点的细胞形态、超微结构和增殖能力,发现3d-rpe细胞具有类似于体内正常rpe细胞的铺路石样形态。细胞顶端出现了大量的微绒毛,色素颗粒主要集中在细胞质上方,细胞核位于细胞质下方,细胞膜的顶端和底端都出现了窖蛋白,细胞之间形成了紧密连接和缝隙连接,粘附连接和桥粒。与分化同一时间点的sd-rpe细胞相比,3d-rpe细胞的增殖能力更强。2、研究3d-rpe细胞在分化不同时间点的基因表达谱,发现3d-rpe细胞在分化至40d时全基因组表达谱最接近于人胚胎rpe;随着分化时间的延长,3d-rpe细胞的与分化成熟相关的基因将逐渐上调,但均低于同一时间点的sd-rpe细胞基因表达水平。3、研究3d-rpe细胞在分化不同时间点的吞噬功能、极性、分泌营养因子功能、紧密连接和缝隙连接,发现3d-rpe细胞比同一时间点的sd-rpe细胞形成了更强的细胞间紧密连接,更早形成了细胞极性,但吞噬感光细胞外节和分泌营养因子的功能不如同一分化时间点的sd-rpe细胞。第二部分:基于不可降解聚酯薄膜(pet)构建的组织工程化人视网膜色素上皮复合体的研究1、研究3d-rpe细胞在pet膜上的生长特性,发现pet/rpe复合体形成了有极性的单层细胞,能够吞噬感光细胞外节、分泌营养因子、形成了紧密连接。2、研究基于pet膜的3d-rpe细胞片移植到rcs大鼠视网膜下腔后对视功能的影响,发现pet/rpe复合体能够延缓rcs大鼠的视网膜变性,与rpe细胞悬液无显著差异,并且pet/rpe复合体移植引起了较严重的炎症反应。第三部分:基于可降解的石墨烯膜构建的组织工程化人视网膜色素上皮复合体的研究1、研究不同修饰的石墨烯纳米颗粒对于眼细胞的毒性,将不同化学修饰、不同表面电荷和不同氧化程度的石墨烯纳米颗粒与四种眼细胞(esc-rpe细胞,人结膜上皮细胞,人角膜上皮细胞,人血管内皮细胞)共培养后检测石墨烯纳米颗粒对于眼细胞的活力、凋亡、氧化应激和线粒体膜电位的影响,发现聚乙二醇(peg)修饰能够显著改善氧化石墨烯(GO)的生物相容性;不同表面电荷的石墨烯纳米颗粒对于眼细胞的活力、凋亡、氧化应激和线粒体膜电位无显著差异;石墨烯的氧化程度与眼细胞的活力呈负相关,与眼细胞的氧化应激反应呈正相关。2、研究3D-RPE细胞在PEG修饰后低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)膜上的生长特性,发现PEG-GO-S/RPE复合体能够分泌营养因子并且形成了紧密连接。3、研究基于PEG-GO-S膜的3D-RPE细胞片移植到RCS大鼠视网膜下腔后的生物相容性,发现PEG-GO-S/RPE复合体移植并没有引起严重的炎症反应。结论:1、3D-RPE细胞具有类似于体内RPE细胞的形态、超微结构、极性和全基因组表达谱,并具有吞噬、分泌营养因子、形成紧密连接和缝隙连接的功能,是一种新的RPE种子细胞。2、3D-RPE细胞随着在体外分化时间延长逐渐成熟,色素加深、增殖能力减弱、细胞极性形成,吞噬功能、营养因子分泌和细胞之间紧密连接等功能逐渐增强;与同一分化时间点的SD-RPE细胞相比,3D-RPE细胞成熟更慢。3、PET膜可用于构建有极性、有功能的单层RPE复合体,PET/RPE复合体移植后可延缓RCS大鼠视网膜变性,但同时也会引起较严重的炎症反应。4、石墨烯的表面化学修饰和氧化程度是决定其对眼细胞产生生物毒性的主要原因,表面电荷对于其生物毒性无显著影响;PEG修饰后的低氧化程度的氧化石墨烯(PEG-GO-S)对眼细胞的生物毒性最低,PEG-GO-S膜可用于构建有功能的单层RPE细胞片,PEG-GO-S/RPE复合体移植后具有良好的生物相容性。