目的:先天性白内障（Congenital Cataract,CC）是一种罕见的儿童眼部疾病,指出生或生后第一年发生的晶体部分或全部混浊,为最常见的可导致儿童时期视力障碍或全盲的疾病之一。约有25%-30%的病人先天性白内障有家族遗传史,最常见遗传方式为常染色体显性遗传,少数为常染色体隐性遗传及X连锁隐形遗传。先天性白内障致病基因及致病机制复杂多样,具有高度遗传异质性。根据晶体混浊部位、形态和程度不同,先天性白内障临床分为全白内障、极性白内障、膜性白内障、核性白内障、中央粉尘状白内障、绕核性白内障、前轴胚胎白内障等类型。其中全白内障与核性白内障的发病率相对较高。目前研究与报道证实该病与80余个基因相关:如编码晶状体蛋白的CRYAA、CRYBB1-3、CRYBA1、CRYGC、CRYGD等基因;编码缝隙连接蛋白的GJA3、GJA8等基因;编码转录调节因子基因PITX3、PAX6等,且新的致病基因不断被筛选出来。本文以中国医科大学基因组学教研室收集到的16个中国汉族白内障家系为研究对象,基于Ion Torrent测序平台检测了 16个家系先证者基因组DNA样品中81个与先天性白内障发生相关的基因,并筛查可疑基因突变,随后利用Sanger测序技术验证突变,排除二代测序假阳性结果,初步明确致病基因。研究方法:1、家系材料中国医科大学医学基因组学教研室收集了 16个分别来自湖北、广东、河南、吉林、福建、山西等地的先天性白内障家系,共收集到76人外周静脉血样本。其中患者46人,表型正常30人,家系遗传方式为常染色体显性遗传。本研究所有受试者均自愿参加并签署了知情同意书。2、家系调查及样本收集对患者进行咨询,了解患者临床表型,并绘制家系系谱图;与患者及其家属签订“知情同意书”;抽取家系成员外周静脉血5ml,并用EDTA抗凝管收集,于-80℃保存备用。3、外周血基因组DNA提取及定量使用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen,Valencia,CA,USA）试剂盒从外周血中提取基因组DNA。采用NanoDrop 2000对提取的基因组DNA进行定量。4、基于Ion Torrent测序平台的高通量测序基于Ion Torrent测序平台对16名先天性白内障家系先证者进行相关致病基因高通量测序,测序及分析流程如下:1)针对81个基因所有外显子及UTR区域设计及合成引物;2)NimbleGen SeqCap EZ Exome Library 建库;3)模板制备与富集;4)Ion Torrent 上机测序;5)数据分析。5、对高通量测序结果进行Sanger测序验证针对高通量测序检测到的基因变异设计PCR扩增引物,扩增产物回收纯化后进行测序验证。结果:1、高通量测序结果在16个家系先证者中完成了总计81个基因的高通量测序,经分析筛选,共筛选出25个可疑改变,其中包括21个错义突变,3个移码突变,1个整码缺失突变。2、Sanger测序验证结果提取家系成员基因组DNA,PCR扩增候选位点,通过Sanger测序筛选出12个基因突变,其中11个基因完成了家系内测序验证,证实在家系内突变与疾病表型共分离。其中2个家系分别检测到2个基因变异,需要继续收集家系成员样品,以期能确定具体哪个基因为该家系致病基因突变。此外,尚有6个家系未检测到基因突变。结论:利用Ion Torrent高通量测序联合Sanger测序,在16个先天性白内障家系中检测到12个基因变异,初步在家系内验证MIP、COL11A1、TRPM3、CRYGD、CRYBA4、TRPM3、CRYBB1、RGS6、PAX6、CRYGC、EPHA2 基因突变可能导致先天性白内障的发生。目的:先天性白内障（Congenital Cataract,CC）是一种罕见的导致儿童时期视力障碍或全盲的疾病。该疾病的发生率为0.01-0.05%,在所有失明儿童患者中,有22-30%为先天性白内障所致。在所有类型的先天性白内障患者中,25%是具有家族遗传性的,以常染色体显性最为多见,部分为常染色体隐性遗传,极少数为性连锁隐性遗传。先天性白内障具有高度遗传异质性,目前至少80余个基因已经被证实与先天性白内障的发病相关,如编码晶体蛋白基因CRYAA、CRYAB、CRYGA、CRYGB、CRYGC、CRYGD、CRYBA1、CRYBA2、CRYGS、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYBA4等,编码缝隙连接蛋白基因GJA3和GJA8等,编码转录因子基因PITX3、PAX6、MAF等,编码膜蛋白基因MIP及EPHA2等。EPHA2基因位于人类染色体1p36,全长3964bp,包含17个外显子,编码976个氨基酸,其编码的EPHA2蛋白属酪氨酸激酶受体,在人类晶体有丰富表达。通过与其配体结合,EPHA2受体蛋白可引发自身构象变化,激活胞浆的酪氨酸激酶而活化,引起细胞内应答。目前研究表明,EPHA2蛋白激酶结构域和SAM结构域的突变,以及其配体ephrinA5功能的缺失都可导致先天性白内障的发生。本课题组前期收集了一个澳大利亚先天性全白内障家系,并证实EPHA2基因内含子16点突变c.2826-9G＞A为此家系的致病突变。该点突变可形成异常剪切位点,导致突变位点后大范围移码。本课题组通过构建含有突变EPHA2基因cDNA序列的转基因载体,利用C57BL/6J小鼠建立先天性白内障转基因动物模型,拟在实验动物水平证实该突变是否可以导致小鼠先天性白内障的发生,在动物体内检测分析EPHA2基因剪切突变对晶体上皮细胞和晶体纤维细胞的形态学影响。研究方法:1、EPHA2基因剪切突变转基因小鼠模型建立采用含有突变型EPHA2基因cDNA全长的tg-epha2-splicing转基因载体,经限制性内切酶KpnI线性化后对C57BL/6 J小鼠受精卵进行雄原核注射,再将受精卵植入代孕母鼠子宫。在转基因载体功能序列设计2对鉴定引物用于整合鉴定。Founder鼠出生后,提取鼠尾组织DNA,采用2对鉴定引物分别对生后3周founder小鼠基因组DNA中整合的转基因序列进行扩增,2次扩增均为阳性的小鼠被确定为整合鉴定阳性。阳性小鼠在生后8周继续与野生型异性C57BL/6J小鼠进行杂交传代,子代小鼠采用相同鉴定引物进行整合鉴定。继续传代至子三代小鼠,采用裂隙灯观察小鼠眼部表型,由临床医师确诊为先天性全白内障。2、转基因鼠表型分析（1）性别统计:对出生8周的转基因阳性小鼠与同窝阴性小鼠进行性别统计,利用Graphpad prism软件进行标准差分析,用以评价转基因是否对转基因小鼠性别比例有影响。（2）一般表型分析:对出生8周的转基因阳性小鼠与同窝阴性小鼠进行身长、体重等外部表型特征进行观察测量,应用Graphpad prism软件做标准差分析,对比转基因阳性小鼠与同窝阴性鼠是否存在表型差异。数码相机拍照留图。（3）眼部表型分析:采用裂隙灯观察转基因阳性小鼠与同窝转基因阴性小鼠晶体组织是否出现浑浊及根据浑浊情况判断白内障小鼠的临床分型。数码相机拍照留图。3、转基因鼠晶体mRNA表达分析分别取转基因阳性小鼠与同窝阴性小鼠晶体组织,Trizol法提取晶体组织总RNA并反转cDNA。在转基因载体上EPHA2基因cDNA序列与poly（A）序列交界处设计RT-PCR引物进行mRNA表达分析,明确转基因在小鼠晶体组织的特异性表达。4、小鼠晶体组织形态学分析取野生及突变型小鼠各一只,颈椎错位法处死后取双侧眼球组织,固定液固定后常规梯度酒精脱水,二甲苯透明及石蜡包埋,5-10μm厚度切片。HE染色观察野生及突变型小鼠晶体细胞大体形态和细胞排列差异。结果:1、EPHA2基因剪切突变转基因小鼠模型建立首建系小鼠共出生75只,经2对鉴定引物PCR鉴定后,确定3只为阳性founder小鼠,均为雌性。经与野生C57BL/6J雄性小鼠杂交传代后,产生3代共277只小鼠,其中转基因阳性鼠105只,阳性率为38%。2、小鼠表型分析（1）性别统计:阳性小鼠中雄性鼠为48只,雌性鼠为57,同窝阴性小鼠共172只,其中雄性鼠89只,雌性83只。阳性小鼠中雄雌性别比为1:1.19,统计学检验无显著性差异。（2）一般表型分析:生后8周转基因阳性小鼠与同窝阴性小鼠未见毛发、身长、体重等指标存在显著性差异。（3）眼部表型分析:全部转基因阳性鼠经裂隙灯检查后均显示全白内障表型,既晶体完全浑浊,与EPHA2基因剪切突变家系患者临床表型完全一致。部分小鼠合并先天性小眼球。3、转基因鼠晶体mRNA表达分析以转基因阳性小鼠与同窝阴性小鼠晶体组织总RNA反转的cDNA为模板进行的RT-PCR结果为阳性,证实转基因在小鼠晶体组织有特异性表达。4、小鼠晶体组织形态学分析HE染色结果显示,野生型小鼠眼球组织结构完整、清晰,晶体上皮细胞与晶体纤维细胞排列致密、规律。突变型小鼠晶体上皮细胞区域出现大小不等空泡样结构,晶体上皮细胞形态改变,呈不规则形状,细胞排列松散。结论:EPHA2基因剪切突变转基因小鼠模型成功建立,在动物水平证实EPHA2 c.2826-9G＞A可导致小鼠先天性全白内障。