TRPV1是一种非选择性阳离子通道，高表达于伤害性感觉神经元。TRPV1可以被辣椒素、氢离子（pH<5.8）、高温（>43°C），以及一些内源性配体如炎症发生时的脂氧化酶产物和大麻素（anandamide）等激活。TRPV1被认为是介导疼痛发生过程中最重要的分子机制之一。TRPV1通道上与辣椒素、氢离子及高温激活有关的位点，通道增敏、脱敏及通道蛋白磷酸化有关的位点已被揭示。TRPV1通道可被多种不同刺激通过不同的激活机制所激活。例如：辣椒素被发现是通过结合在蛋白的胞内侧位置激活通道的，而氢离子则是通过结合在蛋白的胞外侧激活通道的。TRPV1通道的一个显著性特征是该通道活性可以发生增敏或脱敏。这个特征提示TRPV1通道功能可以被广泛调节，从而在特定的生理及病生理情况下发挥作用。电压门控型钾离子通道Kv7家族由KCNQ基因编码。至今为止，共发现这个家族的五个成员：Kv7.1-Kv7.5（KCNQ1-KCNQ5）。KCNQ1编码的Kv7.1主要表达于心肌细胞，Kv7.1/KCNE1被认为是心脏IKs的分子学基础，在调节心肌细胞动作电位时程中发挥着重要作用。Kv7.2及Kv7.3被认为是神经元M电流主要的分子学基础，M电流在调控痛觉感受神经元兴奋性中发挥着重要的作用。KCNQ4编码的Kv7.4主要表达于内耳和听觉神经，近来，越来越多的证据显示KCNQ4基因在大鼠及人的多种血管平滑肌细胞中表达。此外，有研究发现原发性和继发性高血压大鼠胸主动脉和肠系膜动脉的KCNQ4基因的mRNA水平及蛋白水平均大大降低。KCNQ5编码的Kv7.5广泛分布于神经系统，被认为也参与构成了M电流。研究发现KCNQ1、KCNQ4和KCNQ5在多种血管平滑肌细胞中高表达，而KCNQ2和KCNQ3则几乎无表达。此外，越来越多的证据表明Kv7钾离子通道在调节血管平滑肌收缩中发挥着重要作用。本研究论文以上述几种通道为出发点，利用电生理膜片钳、双电极电压钳、基因突变等技术手段，系统研究了以下几方面内容：（1）1,2-二苯乙烯衍生物对大鼠DRG神经元上的TRPV1通道功能的影响及机制；（2）鞣酸抑制大鼠DRG神经元兴奋性及其机制；（3）鞣质类化合物对Kv7钾离子通道的调节；（4）细胞膜去极化对细胞PIP₂水平及Kv7.2/7.3通道电流的影响及机制。论文具体内容如下：第一部分1,2-二苯乙烯衍生物对大鼠DRG神经元上的TRPV1通道功能的影响及机制目的：在分离培养的成年大鼠DRG神经元及HEK293细胞上研究传统的氯离子通道阻断剂1,2-二苯乙烯衍生物DIDS和SITS对辣椒素（CAP）和低pH引发的TRPV1功能的调节。方法：利用电生理穿孔膜片钳技术，在有钙外液和无钙外液情况下观察1,2-二苯乙烯衍生物DIDS和SITS对TRPV1通道电流的调节作用。结果：（1）在成年SD大鼠DRG神经元上，DIDS可增大辣椒素引发的TRPV1电流。DIDS对CAP引发的TRPV1电流的增大作用具有浓度依赖性，其EC₅₀值为4.66±0.77μM。饱和浓度的DIDS可使CAP引发的TRPV1电流平均增大2倍以上。单独应用DIDS并不能引发任何内向电流。DIDS不影响CAP引发的TRPV1电流的快速脱敏反应。DIDS可加快CAP引发的TRPV1电流的激活时程。（2）在细胞外液无Ca²⁺条件下，DIDS增大CAP引发的TRPV1电流的量效关系，其EC₅₀为4.88±0.74μM，与在有Ca²⁺条件下测得的EC₅₀无明显差异。（3） DIDS（10μM）可很大程度地增大内源性配体anandamide引发的TRPV1电流，但不影响电流的快速脱敏反应。（4） DIDS可浓度依赖性地增大低pH引发的TRPV1电流，EC₅₀值为1.83±0.29μM。饱和浓度的DIDS（10μM）可使低pH引发的TRPV1增大448±69%。DIDS可阻断多次给予低pH刺激引发的TRPV1电流的快速脱敏反应。DIDS可加快低pH引发的TRPV1电流激活的时程。（5） DIDS可增大低pH刺激引发的内向电流由TRPV1通道介导，而与其它的酸敏感通道无关。（6） DIDS增大TRPV1通道的作用与其水解产物无关。（7） SITS不能增大CAP引发的TRPV1电流的作用，可选择性的增大低pH引发的TRPV1电流。（8） DIDS可增大表达于HEK293细胞中的TRPV1电流。在细胞外液无Ca²⁺的条件下，DIDS增大CAP引发的TRPV1电流作用的EC₅₀为3.21±0.10μM。DIDS（100μM）可使CAP激活TRPV1电流的量效曲线显著左移。DIDS使得TRPV1半最大激活电压(V_1/2)由40±5mV左移至-42±7mV。（9） DIDS不是通过已知的调节靶点增大TRPV1电流。结论：（1）在成年SD大鼠DRG神经元上，DIDS可增大辣椒素引发的TRPV1电流。（2）在细胞外无Ca²⁺情况下，DIDS对CAP引发的TRPV1电流的作用与在有Ca²⁺情况下的作用相似。（3） DIDS也能增大vanilloid受体内源性配体anandamide引发的TRPV1电流。（4） DIDS可增大低pH刺激引发的TRPV1电流，并阻断多次给予低pH刺激引发的TRPV1电流的快速脱敏反应。（5） DIDS增大的低pH刺激引发的内向电流由TRPV1通道介导，而与其它的酸敏感通道无关。（6） DIDS增大TRPV1通道的作用与其水解产物无关。（7） SITS可选择性地增大低pH引发的TRPV1电流。（8） DIDS可增大表达于HEK293细胞中的TRPV1电流。（9） DIDS不是通过已知的调节靶点增大TRPV1电流。第二部分鞣酸抑制大鼠DRG神经元兴奋性及其机制目的：研究鞣酸对大鼠小直径背根神经元兴奋性的影响及其离子机制。方法：利用电生理穿孔膜片钳技术，观察鞣酸对小直径背根神经元兴奋性及离子电流的影响。结果：（1）1μM、10μM鞣酸可以显著抑制小直径背根神经元自发性重复放电，并且延长动作电位之间的间隔。另外，可以观察到retigabine导致膜电位超极化，但鞣酸并没有影响细胞静息膜电位水平。（2）细胞外给予鞣酸可快速、可逆地增大Kv7/M电流。鞣酸达到其最大稳态作用约需2分钟的时间。鞣酸增大Kv7/M电流的作用具有浓度依赖性，其半数有效浓度为4.4±0.1μM。饱和浓度的鞣酸可使Kv7/M电流增大约一倍。（3）鞣酸可浓度依赖性增大外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.2和Kv7.2/7.3钾离子通道电流，其半数有效浓度分别为5.40±0.82μM、7.38±1.57μM。饱和浓度的鞣酸可使Kv7.2及Kv7.2/7.3钾离子通道电流增大2倍以上。鞣酸（10μM）可以增大Kv7.2（W236L）钾离子通道电流，增大的幅度与野生型Kv7.2钾离子通道电流无区别（Kv7.2WT:1.34±0.04;Kv7.2（W236L）:1.53±0.20）。这说明鞣酸与retigabine增大Kv7.2钾离子通道电流的机制不同，Trp236不是鞣酸作用的关键位点。（4）鞣酸（10μM）可迅速逆转缓激肽引发的神经元兴奋性增高。鞣酸可以逆转Kv7/M阻断剂XE991（3μM）引发的神经元兴奋性增高。这个结果提示，鞣酸抑制神经元兴奋性可能是通过作用于多靶点而发挥作用的。（5）鞣酸剂量依赖性地抑制小直径DRG神经元上TTX敏感的电压门控性钠电流，其半数有效浓度分别为5.25±0.26μM。饱和浓度的鞣酸可100%阻断TTX敏感的Na⁺电流。（6）鞣酸剂量依赖性抑制小直径DRG神经元上外向钾电流。饱和浓度的鞣酸可以抑制-50%的外向K⁺电流，其作用的半数有效浓度为6.55±1.18μM。结论：（1）鞣酸显著抑制小直径DRG神经元自发性重复放电。（2）鞣酸可剂量依赖性增大小直径DRG神经元上表达的Kv7/M型钾电流。（3）鞣酸可浓度依赖性增大外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.2和Kv7.2/7.3钾离子通道电流。（4）鞣酸可抑制缓激肽引发的小直径DRG神经元的兴奋性增高。（5）鞣酸剂量依赖性抑制小直径DRG神经元上TTX敏感的电压门控性钠电流。（6）鞣酸剂量依赖性抑制小直径DRG神经元上外向钾电流。第三部分鞣质类化合物对Kv7钾离子通道的调节目的：研究鞣质类化合物对HEK293细胞上表达的Kv7钾离子通道电流的调节作用。方法：利用电生理穿孔膜片钳技术，观察鞣质类化合物对Kv7钾离子通道电流的调节作用。结果：（1）鞣酸可增大外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.1/KCNE1钾离子通道电流，其半数有效浓度为5.16±0.43μM。饱和浓度的鞣酸可使Kv7.1/KCNE1钾离子通道电流增大2倍以上。并且，鞣酸使Kv7.1/KCNE1钾离子通道电流在-40mV在记录得到的去激活尾电流时程明显减慢。（2）10μM鞣酸可抑制豚鼠心室肌细胞IKs电流。（3）鞣酸可剂量依赖性地抑制外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.1钾离子通道电流。鞣酸可剂量依赖性地增大Kv7.3/7.5钾离子通道电流。鞣酸对Kv7.3/7.5钾离子通道电流的激活作用可能参与介导了鞣酸的扩血管作用。（4）鞣酸可剂量依赖性地增大外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.4钾离子通道电流，其半数有效浓度为27.3±3.6μM。饱和浓度的鞣酸可使Kv7.4钾离子通道电流增大约4倍。鞣酸对Kv7.4钾离子通道电流的激活作用可能参与介导了鞣酸的扩血管作用。（5）10μM的槲皮素、10μM儿茶素及10μM白藜芦醇均不影响Kv7.1/KCNE1钾离子通道电流。（6）10μM槲皮素、10μM鞣酸、10μM Retigabine分别可使Kv7.2/7.3钾离子通道电流增大128±18%、130±13%、243±31%。10μM儿茶素抑制Kv7.2/7.3钾离子通道电流，抑制率为40±8%。10μM白藜芦醇对Kv7.2/7.3钾离子通道电流有轻微的增大作用，但与基础值相比无显著性差异（16±6%）。（7）10μM槲皮素、10μM鞣酸、10μM Retigabine分别可使Kv7.4钾离子通道电流增大87±10%、146±46%、297±13%。10μM儿茶素及10μM白藜芦醇不影响Kv7.4钾离子通道电流。结论：（1）鞣酸增大外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.1/KCNE1钾离子通道电流，且这种抑制作用具有剂量依赖性。（2）鞣酸抑制豚鼠心室肌细胞IKs电流。（3）鞣酸抑制外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.1钾离子通道电流，增大Kv7.3/7.5钾离子通道电流。（4）鞣酸增大外源性表达于HEK293细胞上的Kv7.4钾离子通道电流。（5）槲皮素、儿茶素及白藜芦醇均不影响Kv7.1/KCNE1钾离子通道电流。（6）槲皮素可增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流。儿茶素可抑制Kv7.2/7.3钾离子通道电流。白藜芦醇不影响Kv7.2/7.3钾离子通道电流。（7）槲皮素可增大Kv7.4钾离子通道电流。儿茶素及白藜芦醇不影响Kv7.4钾离子通道电流。第四部分细胞膜去极化对细胞膜PtdIns（4,5）P₂水平及Kv7.2/7.3钾离子通道电流的影响及机制目的：研究细胞膜电位去极化对细胞膜PIP₂调节的分子学机制。方法：利用双电极电压钳技术及薄层色谱技术观察膜电位去极化对外源性表达于非洲爪蟾卵母细胞中的Kv7.2/7.3，Kir2.1，Kir2.3钾离子通道电流及细胞膜PIP₂的调节。结果：（1）细胞膜电位去极化可增大外源性表达于非洲爪蟾卵母细胞中的Kv7.2/7.3钾离子通道电流。膜电位去极化增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流具有电压依赖性，其半最大激活电压(V_1/2)为–26.1±0.5mV。Kv7.2/7.3钾离子通道激活和去活时程在长时间膜电位去极化钳制（0mV，15min）前后无改变（激活时间常数分别为：172±4ms，177±7ms；去活时间常数分别为：163±3ms，162±10ms）。膜电位去极化不影响Kv7.2/7.3钾离子通道电流的电导-电压关系曲线。长时间膜电位去极化（0mV，15min）钳制前后，Kv7.2/7.3钾离子通道电流的电导-电压关系曲线未发生位移（15min前后分别为-28.7±0.5mV，-29.6±0.4mV）。（2）单独表达的Kv7.2钾离子通道电流同样具有电压依赖性的特点。与Kv7.2/7.3钾离子通道电流相比，去极化钳制使Kv7.2钾离子通道电流增大幅度更大。但二者的电压依赖性特点无差异，其半最大激活电压分别为Kv7.2：-29.1±2.4mV，Kv7.2/7.3：–26.1±0.5mV。（3） ND96K细胞外液孵育卵母细胞15min可以增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流。ND96K细胞外液孵育引起的电流增大幅度与低钾ND96下电压钳制在0mV（15min）无明显差异（ND96K细胞外液孵育组电流增大183±4%，0mV电压钳制组电流增大205±6%）。高钾引起的膜电位去极化不影响Kv7.2/7.3钾离子通道的激活特性(15min前后分别为V_1/2=-28.7±0.3mV，V_1/2=-27.2±0.5mV)。以上结果提示膜电位去极化本身可增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流，与钾离子外流增加无关。（4） Kv7.2/7.3钾离子通道电流可在Ci-VSP去活后迅速恢复。激活Ci-VSP后虽然使Kv7.2/7.3钾离子通道电流迅速降低，但并未阻断膜电位去极化引起的电流增加。薄层色谱（TLC）的方法检测到与对照组相比，高钾外液孵育15min和膜电位去极化钳制在0mV,15min，可分别使细胞膜PIP和PIP₂水平增大49±4%和43±7%、71±9%和55±10%。膜电位长时间钳制在去极化电压可使Kir2.1及Kir2.3钾离子通道电流显著增大。并且，与Kir2.1钾离子通道电流相比，膜电位去极化引起的Kir2.3钾离子通道电流增大幅度更大。Kir2.3钾离子通道电流增至初始值的94±8%，Kir2.1增至初始值的53±8%。这个结果与之前发现的Kir2.3钾离子通道蛋白与PIP₂的亲和力小于Kir2.1通道蛋白相吻合。这部分研究结果表明膜电位去极化引起的Kv7.2/7.3钾离子通道电流增大是通过提高细胞膜PIP₂水平实现的。（5） PI4-激酶的阻断剂wortmannin预孵育卵母细胞10min，可显著抑制膜电位去极化对Kv7.2/7.3钾离子通道电流的增大作用。双链RNA干扰（PI4-K）技术抑制膜电位去极化引发的PI4激酶的表达，并可完全阻断膜电位去极化引发的Kv7.2/7.3钾离子通道电流的增大。此外，双链RNA同样可抑制膜电位去极化引发的细胞膜PIP₂的提高。（6）与处于静息条件下的细胞（钳制在-70mV，0Hz）比较，低频率（10Hz）的生理性膜电位活动（模拟神经元动作电位）可以增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流。高频率刺激（20Hz）可使Kv7.2/7.3钾离子通道电流增至更高的水平。结论：（1）膜电位去极化可增大外源性表达于非洲爪蟾卵母细胞中的Kv7.2/7.3钾离子通道电流但不影响Kv7.2/7.3钾离子通道电流动力学时程及电导-电压关系曲线。（2）膜电位去极化引起的Kv7.2/7.3钾离子通道电流增大具有亚基特异性的特点。（3）高钾外液孵育可使膜电位去极化并增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流。（4）膜电位去极化引起的Kv7.2/7.3钾离子通道电流增大是通过提高细胞膜PIP₂水平实现的。（5）膜电位去极化引起的细胞膜PIP₂水平升高是由于激活了PI4-激酶引起的。（6）模拟动作电位的生理性刺激可频率依赖性地增大Kv7.2/7.3钾离子通道电流。