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背景水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是一组与水的跨膜转运有关的膜蛋白家族,其中水通道蛋白4(Aquaporin-4, AQP4)在脑组织中广泛分布,已有研究表明AQP4是星形胶质细胞水肿形成的限速环节。本课题组前期的研究已发现用3%氯化钠处理15min,星形胶质细胞膜表面AQP4水平明显降低,而20%甘露醇却没有此作用。提示3%氯化钠减轻脑水肿、降低颅内压的机制除同20%甘露醇所具有的渗透性脱水机制外还有更重要的非渗透机制的参与。目的观察3%氯化钠对细胞膜AQP4蛋白内化的影响。方法(1)采用pEGFP-AQP4-M23重组质粒转染U251细胞,建立稳定转染细胞系,通过抗AQP4免疫荧光法鉴定稳定表达AQP4的U251细胞。(2)采用乳酸脱氢酶及MTT比色法观察3%氯化钠对U251细胞的损伤。(3)通过多功能酶标仪、激光共聚焦及流式细胞仪三种方法观察3%氯化钠溶液对U251细胞AQP4内化的影响。(4)通过多功能酶标仪测定3%氯化钠溶液对U251胞内钙离子浓度的影响。结果1.成功构建稳定表达AQP4的U251细胞。2.20%甘露醇处理0-30min,细胞培养液中LDH含量及MTT细胞存活率均无明显变化；3%氯化钠处理0～25min,细胞培养液中LDH含量及MTT细胞存活率均无明显变化,当时间延长至30min时,虽细胞培养上清液中LDH含量无明显增加,但细胞存活率与0min相比显著下降(p<0.05)。3.20%甘露醇处理0～25min,U251细胞AQP4绿色荧光及细胞膜上抗AQP4抗体红色荧光强度无明显变化。3%氯化钠处理0～25min对U251细胞AQP4绿色荧光强度无明显影响,但在处理5min时即可显著减少细胞膜抗AQP4抗体的红色荧光强度(p<0.05),随处理时间延长至15min时细胞红色荧光强度降到最低点；随后随着时间的延长至20min和25min细胞的红色荧光强度有反弹上升；激光共聚焦显微镜下观察到处理前U251细胞的绿色荧光主要集中表达在胞膜,3%氯化钠处理后绿色荧光主要集中在胞浆中；流式细胞仪测定结果显示,3%氯化钠处理前后U251细胞AQP4的绿色荧光强度无明显变化,而U251细胞膜上的抗AQP4抗体的红色荧光及结合有抗体的阳性细胞比率明显下降p<0.05)。4.3%氯化钠处理U251细胞15min可引起细胞内钙离子浓度的升高(p<0.05)。结论(1)成功建立稳定表达AQP4绿色融合蛋白的U251细胞。(2)3%氯化钠溶液处理U251细胞25min内不引起细胞膜的损伤和细胞的死亡。(3)3%氯化钠可促进细胞膜上AQP4蛋白的内化,20%甘露醇无此作用。(4)3%氯化钠可提高细胞内钙离子浓度。