课题组前期将雌雄不同性别供体C57小鼠来源的CD3+T细胞分别移植入雄性Rag-1-/- (Recombination activating gene-1 knocked)小鼠体内,给予AngⅡ (AngiotensinⅡ,血管紧张素II)干预后,发现雄性Rag-1-/-小鼠在给予雄性CD3+T细胞移植后(CD3M→Rag-1-1--M)血压较雄性Rag-1-/-小鼠在给予雌性CD3+T细胞移植后(CD3F→Rag-1-/--M)高,且与CDF→Rag-1-/--M比较,CD3M→Rag-1-/--M血浆及肾脏内IL-17A(Interlukin-17A,白细胞介素-17A)及TNF-α (Tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子α)前炎症因子水平较高,而IL-10(Interlukin-10,白细胞介素-10)这一保护因子水平CD3F→Rag-1-1--M比CD3M→Rag-1-/--M高,从而证实：供体的性激素及性染色体类型对T细胞分化的影响是导致受体接受T细胞移植后,针对AngⅡ作用血压高低差异的原因。高血压的性别差异与T细胞分化之间的关系究竟与性激素还是性染色体更为密切?本课题组与其他课题组合作又进行了进一步验证。将供体雄性C57小鼠的CD3+T细胞分别移植给雌雄不同性别的受体Rag-1/-/-小鼠,给予AngⅡ干预后,发现给予雄性CD3+T细胞移植后的雄性Rag-1-/-小鼠(CD3M→Rag-1/-/--M)的血压要明显高于给予雄性CD3+T细胞移植后的雌性Rag-1-/-小鼠(CD3M→Rag-1-/--F)的血压,从而证实：受体的性别,即受体产生的主要性激素的类型的差异是导致高血压性别差异的原因,其中,雌激素有对抗高血压的作用。为进一步研究性激素及性染色体在高血压的性别差异中各自的作用及性别差异对高血压T细胞分化的影响。课题组现建立Rag-1-/-小鼠植入C57小鼠骨髓细胞的骨髓移植模型。将雌雄不同性别供体C57小鼠来源的骨髓细胞分别移植入雄性Rag-1-/-小鼠体内,并给予AngⅡ干预,观察雄性Rag-1-/-小鼠在给予雄性骨髓细胞移植后(BMM→Rag-1-/--M)与雄性Rag-1-/-小鼠在给予雌性骨髓细胞移植后(BMF→Rag-1-/--M)两者血压及心率的差异,检测全血及小鼠脾细胞中T细胞亚型的分化情况。课题组又建立去势的雌、雄SHR (spontaneously hypertensive rats,自发型高血压大鼠)模型,皆给予补充外源性雌、雄激素,观察性激素与性染色体对高血压的影响；通过检测外周血及脾细胞中T细胞亚型的分化情况,探索高血压性别差异与T细胞免疫之间的关系；同时,观察淫羊藿苷调节血压的类性激素作用,探索其对高血压T细胞分化的影响。本研究将为植物类性激素应用于临床调节不同性别患者血压提供一定实验依据。本课题研究分为两部分：文献综述和实验研究。1.文献综述：本部分从性激素与高血压、高血压性别差异与T细胞免疫研究进展、淫羊藿苷的心血管保护作用及机制研究进展三个方面进行综述。2.实验研究：包括以下三个部分。研究一Rag-1-/-小鼠骨髓移植辐射剂量确定及骨髓移植成功率检测目的：探索受体Rag-1-/-小鼠骨髓移植辐射剂量,并通过流式细胞术检测受体Rag-1-/-小鼠在植入供体B6小鼠骨髓细胞后B6小鼠骨髓细胞所占比例,鉴定骨髓移植手术是否成功。为后续研究提供较为成熟的骨髓移植模型。方法：选取骨髓细胞(bone marrow cells,BM)表面表达CD90.2(即CD90.2+)的具有免疫缺陷的Rag-1-/-小鼠做受体,骨髓细胞表面表达CD90.1(即CD90.1+)的雄性B6小鼠作为供体,在Rag-1-/-小鼠接受500rads或800rads伽马射线照射干预后,将B6小鼠骨髓细胞分离提取,并以5×107个细胞／只的剂量经眼球后静脉丛注入Rag-1-/-小鼠体内形成B6-BM→Rag1-/-复合体小鼠。三周后,通过流式细胞仪检测复合体小鼠外周血由骨髓细胞分化而来的外周单个核细胞表面CD90.1表达比例,推测骨髓移植成功与否。结果：①Rag-1-/-小鼠在给予500rads衬线照射后,无论是否给予B6小鼠骨髓移植,都能够健康存活至照射后50天,体重逐渐增加。而给予800rads照射的Rag-1-/-小鼠,未给予骨髓移植(Rag-1-/--M+800rads组),则小鼠在照射后三周内体重骤然降低,陆续死亡；而给予B6小鼠骨髓移植的Rag-1-/-小鼠(BMM→Rag-1-/-M +800rads)却能够健康存活达射线照射后的50天,体重逐渐增加。②流式细胞检测结果表明,Rag-1-/-小鼠外周血单个核细胞表面主要表达CD90.2(96.12±0.83%)。B6小鼠单个核细胞表面主要表达CD90.1(98.85±1.04%)。当用500rads的射线照射Rag-1-/-小鼠并给予B6小鼠骨髓细胞移植,骨髓分化而来的单个核细胞表而CD90.1的比例只有49.7±0.97%,而CD90.2的比例也只有50.3±1.11%。当用800rads射线照射Rag-1-/-小鼠并给予B6小鼠骨髓细胞移植,则检测由骨髓分化来的单个核细胞表面CD90.1表达可达93.16±1.53%,大于90%。结论：800rads伽马射线照射Rag-1-/-小鼠能够不可逆的损伤其骨髓细胞,给予照射后的Rag-1-/-小鼠接受来自供体B6小鼠5×107个骨髓细胞移植后,供体B6小鼠骨髓细胞替代比例达90%以上。骨髓移植模型成功。研究二高血压鼠性别差异与T细胞免疫调节的关系的研究目的：研究性染色体在高血压性别差异中的作用,及雌雄性染色体差异对T细胞分化的影响。方法：给予受体雄性Rag-1-/-小鼠800rads伽马射线照射并分别植入雌、雄(M orF)不同性别供体C57小鼠的骨髓细胞建立BMM→Rag-1-/--M及BMF→Rag-1--/-M复合体模型。通过皮下植入AngⅡ缓释泵,给予两种复合体小鼠AngⅡ干预后,观察雄性Rag-1-/-小鼠在植入具有雌、雄不同性染色体的骨髓细胞后,两类复合体小鼠生存时间、体重、血压、心率的差异。同时,应用流式细胞术检测具有雌、雄不同性染色体的骨髓细胞在移植入同一性激素内环境下分化的外周血及脾细胞中T细胞分化亚型的情况。结果：①与未行射线干预的Rag-1/-/--M组小鼠相比,BMF→Rag-1-/--M +800rads组及BMM→Rag-1-/--M+800rads组小鼠皆能健康存活至骨髓移植后54天。而给予800rads射线照射而未给予骨髓移植的Rag-1-/--M+800rads组小鼠在接受辐射后23天内相继死去。②骨髓移植术后,与BMF→Rag-1-/--M+800rads组相比BMM→Rag-1-/--M+800rads组小鼠体重明显增加(P<0.01)。③在AngⅡ干预后,BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠血压明显高于BMM→Rag-1-/--M+800rads组(P<0.01)。④在AngⅡ干预后,BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠心率明显快于BMM→Rag-1-/--M+800rads组(P<0.01)。⑤小鼠外周血T细胞亚型差异比较：在给予AngⅡ干预后,BMM→Rag-1-/--M +800rads组与BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠外周血Tc(Cytotoxic T lymphocytes,杀伤T细胞)及Th(T helper lymphocytes,辅助T淋巴细胞)比例无明显差异(P>0.05)；而与BMM→Rag-1-/--M+800rads组相比,BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠外周血Th17 (Thelp 17 lymphocytes,辅助T17淋巴细胞)比例明显增加(P<0.01)；与BMM→Rag-1-/--M+800rads组相比,BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠外周血Tregs (regulatory T cells,调节T细胞)细胞比例有增加的趋势(P>0.05)。⑥小鼠脾细胞中T细胞亚型差异比较：在给予AngⅡ干预后,BMM→Rag-1-/--M +800rads组与BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠脾细胞中Tc细胞及Th细胞比例无明显差异(P>0.05)；与BMM→Rag-1-/--M+800rads组相比,BMF→Rag-1-/--M +800rads组小鼠脾细胞中Th17细胞比例明显增加(P<0.01)；与BMM→Rag-1-/--M +800rads组相比,BMF→Rag-1-/--M+800rads组小鼠脾细胞Tregs细胞比例无明显差异(P>0.05)。结论：性染色体差异是除性激素外另一个导致高血压性别差异的因素。在性激素类型相同的条件下,与雄性性染色体相比,雌性性染色体的存在能够升高T细胞亚型中Th17细胞亚型的分化比例,从而使个体针对AngⅡ产生较高的血压。研究三淫羊藿苷对自发型高血压大鼠血压调节的类性激素效应及机制研究目的：观察外源性性激素及本身性染色体对去势SHR大鼠血压、心率、外周血及脾细胞中T细胞亚型分化的影响。同时探索淫羊藿苷对去势SHR大鼠血压调节的类性激素作用,并研究其作用机制。方法：给予雄性SHR大鼠睾丸切除术及给予雌性SHR大鼠卵巢切除术建立雌雄去势高血压模型。分别给予雌、雄去势高血压大鼠雌二醇、睾酮及高低剂量的淫羊藿苷,雌雄激素受体抑制剂等药物干预,将去势雄性实验用鼠共分为以7个组：对照组(WKY-M组),模型组(SHR-M),雌二醇组(SHR-E2-M, E2:0.1mg/kg/day),睾酮组(SHR-T-M, T:26mg/kg/month),淫羊藿苷低剂量组(SHR-I-M, Icariin: 20mg/kg/day),淫羊藿苷高剂量组(SHR-HI-M, Icariin:40mg/kg/day).淫羊藿苷高剂量+雄激素受体抑制剂组(SHR-HI+Flu-M, Icariin:40mg/kg/day, Flutamide: 22.3mg/kg/8 hours)。将去势雌性实验用鼠共分为以下7个组：对照组(WKY-F组),模型组(SHR-F),雌二醇组(SHR-E2-F, E2:0.1 mg/kg/day),睾酮组(SHR-T-F, T:26mg/kg/month),淫羊藿苷低剂量组(SHR-I-F, Icariin:20mg/kg/day),淫羊藿苷高剂量组(SHR-HI-F, Icariin:40mg/kg/day).淫羊藿苷高剂量+雌激素受体抑制剂组(SHR-HI+ICI-F,Icariin:40mg/kg/day, Fulvestrant/ICI 182780: 52mg/kg/month)。定期检测各组大鼠体重、血压、心率变化。给药6周后处死大鼠,取大鼠脾脏、心脏、左右肾脏、及子宫(雌性),计算大鼠各脏器系数。取抗凝血用于外周血单个核细胞中T细胞亚型Tc、Th、Tregs分化比例的流式细胞检测。分离脾细胞用于脾细胞中T细胞亚型Tc、Th、Tregs分化比例的流式细胞检测。取促凝血用于大鼠血清中雌二醇、睾酮、AngⅡ、TNF-α、IL-17水平的检测Elisa指标检测。分离主动脉用于主动脉的HE染色及Masson染色,同时也用于主动脉ERβ(estrogen receptor beta,雌激素受体p)及AR (androgen receptor,雄激素受体)蛋白表达的Western-blot检测。结果：①给予睾酮干预后,雄性SHR大鼠体重明显增加(P<0.01)。给予雌二醇干预后,雌性SHR大鼠体重明显降低(P<0.01)。给予淫羊藿苷干预,雌雄去势SHR大鼠体重无明显变化(P>0.05)。②给予雌二醇、淫羊藿苷都能够使去势的雄性SHR大鼠血压降低(P<0.01),而给予睾酮却能使血压升高(P<0.01)。给予雌二醇及淫羊藿苷能够使去势雌性SHR大鼠血压降低(P<0.01),而给予睾酮却能够使血压升高(P<0.01)；且淫羊藿苷这种作用能够被雌激素受体拮抗剂所阻断(P<0.01)。③给予去势雄性SHR大鼠睾酮及淫羊藿苷高剂量干预能够明显降低其心率(P<0.01),而雌二醇对心率无明显影响(P>0.05)。淫羊藿苷高剂量的作用能够被雄激素受体拮抗剂所阻断(P<0.01)。给予去势雌性SHR大鼠睾酮及淫羊藿高剂量干预能够明显降低心率(P<0.01),而雌二醇对心率无明显影响(P>0.05)。④睾酮能够增加去势雄性SHR大鼠心脏及左右肾脏重量(P<0.01)。与雌性WKY组大鼠相比,雌性SHR组大鼠脾脏重量明显增加(P<0.01)。睾酮能够增加去势雌性SHR大鼠心脏、子宫及左右肾脏重量(P<0.01),而降低脾脏重量(P<0.01)。雌二醇能够降低去势雌性SHR大鼠脾脏重量明显(P<0.01),却对心脏及双肾重量无明显影响(P>0.05)；淫羊藿苷高剂量能够降低去势雌性SHR大鼠脾脏重量(P<0.01)。⑤大鼠主动脉HE及Masson染色结果示：雌雄去势SHR大鼠较其同一性别WKY对照组主动脉的纤维化程度高。给予雄性去势SHR大鼠雌二醇及淫羊藿苷干预能够降低其主动脉纤维化程度,而给予睾酮却无明显改善。且淫羊藿苷改善去势雄性SHR大鼠主动脉纤维化的作用能够被雄激素受体拮抗剂阻断。给予雌性去势SHR大鼠雌二醇及淫羊藿苷干预能够降低其主动脉纤维化程度,而给予睾酮则无明显改善。且淫羊蓿苷降低去势雌性SHR大鼠主动脉纤维化的作用能够部分被雌激素受体拮抗剂所阻断。⑥各组大鼠外周血流式细胞检测结果：睾酮及淫羊藿苷能够降低去势雄性SHR大鼠外周血中Th细胞分化比例(P<0.01),雌二醇却无明显影响(P>0.05)。雌二醇、睾酮、淫羊藿苷对去势雌性SHR大鼠外周血Th细胞无明显影响(P>0.05)。睾酮、淫羊藿苷能够降低去势雄性SHR大鼠外周血Tc细胞分化比例(P<0.05),而雌二醇却无此作用(P>0.05)。且淫羊藿苷的作用能够被雄激素受体拮抗剂阻断(P<0.05)。雌二醇、淫羊藿苷能够降低去势雌性SHR大鼠外周血Tc细胞分化比例(P<0.05),而睾酮无此作用(P>0.05)。睾酮、淫羊藿苷能够增加去势雄性SHR大鼠外周血Tregs细胞分化比例(P<0.05或P<0.01),而雌二醇却无此作用(P>0.05)。雌二醇、淫羊藿苷能够升高去势雌性SHR大鼠外周血Tregs细胞分化比例(P<0.01),而睾酮无此作用(P>0.05)。且淫羊藿苷的作用能够被雌激素受体拮抗剂阻断(P<0.01)。⑦各组大鼠脾细胞流式细胞检测结果：雌二醇、睾酮及淫羊藿苷对去势雌雄性SHR大鼠脾细胞中Th细胞分化比例皆无明显影响(P>0.05)。睾酮及淫羊藿苷能够降低去势雄性SHR大鼠脾细胞中Tc分化比例(P<0.05),而雌二醇无此作用(P>0.05)。且淫羊藿苷的作用能够部分被雄激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。雌二醇及淫羊藿苷有降低去势雌性SHR大鼠脾细胞中Tc分化比例的趋势(P>0.05),且淫羊藿苷的作用能够部分被雌激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。淫羊藿苷能够增加去势雄性SHR大鼠脾细胞中Tregs分化比例(P<0.05),睾酮有增加去势雄性SHR大鼠脾细胞中Tregs分化比例的趋势(P>0.05),而雌二醇无此作用(P>0.05),且淫羊藿苷的作用能够部分被雄激素受体拮抗剂阻断(P<0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能够增加去势雌性SHR大鼠脾细胞中Tregs分化比例(P<0.01或P<0.05),而睾酮无此作用(P>0.05),且淫羊藿苷的作用能够被雌激素受体拮抗剂阻断(P<0.05)。雌二醇、睾酮及淫羊藿苷能够降低去势雄性SHR大鼠T细胞细胞因子TNF-α含量(P<0.01)。且淫羊藿苷的作用能够部分被雄激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能够降低去势雌性SHR大鼠T细胞细胞因子TNF-α含量(P<0.05),而睾酮无此作用(P>0.05),且淫羊藿苷的作用能够部分被雌激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。雌二醇及淫羊藿苷对去势雄性SHR大鼠T细胞细胞因子IL-17含量无明显影响(P>0.05),而睾酮能够明显升高IL-17含量(P<0.01)。雌二醇、睾酮及淫羊藿苷能够降低去势雌性SHR大鼠T细胞细胞因子IL-17含量(P<0.01)。⑨血清雌二醇、睾酮、AngⅡ、TNF-α,1L-17,IL-10含量Elisa检测结果：雌二醇能够升高去势雄性SHR大鼠血清E2水平(P<0.01),而睾酮及淫羊藿苷无此作用(P>0.05)。雌二醇及睾酮都能够升高去势雌性SHR大鼠血清E2水平(P>0.05),而淫羊藿苷却不能(P>0.05)。雌二醇、睾酮及淫羊藿苷皆对去势雄性SHR大鼠血清睾酮水平无明显影响(P>0.05)。雌二醇能够降低去势雌性SHR大鼠血清睾酮水平(P>0.05),而睾酮能够明显升高去势雌性SHR大鼠血清睾酮水平(P<0.01),而淫羊藿苷对睾酮水平无影响(P>0.05)。雌二醇能够一定程度降低去势雄性SHR大鼠血清AngⅡ水平(P>0.05),睾酮能够增加其血清AngⅡ水平(P<0.01),淫羊藿苷能够明显降低AngⅡ水平(P<0.05或P<0.01)。雌二醇能够降低去势雌性SHR大鼠血清AngⅡ水平(P<0.01),而睾酮明显升高其AngⅡ水平(P<0.01),而淫羊藿苷对AngⅡ水平无影响(P>0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能够降低去势雄性SHR大鼠血清TNF-α水平(P<0.01),而睾酮能够升高其TNF-α水平(P<0.01),且淫羊藿苷作用能够部分被雄激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。雌二醇能够降低去势雌性SHR大鼠血清TNF-α水平(P<0.01),而睾酮有升高其TNF-α水平的趋势(P>0.05),而淫羊藿苷对TNF-α水平无影响(P>0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能够减低去势雄性SHR大鼠血清IL-17水平(P<0.01),而睾酮有升高其血清IL-17水平的趋势(P>0.05)。且淫羊藿苷作用能够部分被雄激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。雌二醇能够降低去势雌性SHR大鼠血清IL-17水平(P<0.01),而睾酮有升高其IL-17水平的趋势(P>0.05),且淫羊藿苷的作用能够被雌激素受体拮抗剂阻断(P<0.01)。⑩大鼠主动脉雌、雄激素受体含量比较雌二醇能够一定程度增加去势雄性SHR大鼠主动脉ERp表达水平(P>0.05),而睾酮对ERp表达水平无明显影响(P>0.05),淫羊藿苷能够降低ERp表达水平(P<0.01)。雌二醇及睾酮能够一定程度增加去势雌性SHR大鼠主动脉ERβ表达水平(P>0.05),而淫羊藿对ERβ表达水平无明显影响(P>0.05)。雌二醇及淫羊藿苷能够明显降低去势雄性SHR大鼠主动脉AR表达水平(P<0.01),而睾酮对其AR表达水平无明显影响(P>0.05),且淫羊藿苷的作用能够部分被雄激素受体拮抗剂阻断(P>0.05)。雌二醇、睾酮及淫羊藿苷皆能降低去势雌性SHR大鼠主动脉AR表达水平(P<0.01)。结论：1.雌二醇能够降低去势雌性SHR大鼠的血压,这一作用是与雌二醇降低AngⅡ的释放,改善主动脉纤维化及炎症细胞浸润,增加其外周血及脾细胞中T细胞Tregs亚型的分化比例而降低Tc亚型的分化比例有关。而雌二醇降低去势雄性SHR大鼠血压与雌二醇对外周血及脾细胞中T细胞亚型分化比例的调节无关。2.睾酮能够升高去势雌、雄SHR大鼠的血压,降低雌、雄SHR大鼠的心率。此作用是与睾酮增加AngⅡ的释放,增加主动脉纤维化及炎症细胞浸润有关,而与调节外周血及脾细胞中T细胞亚型分化比例无关。3.淫羊藿苷具有类性激素作用,在不增加去势雌、雄SHR大鼠血清雌二醇及睾酮水平及雌、雄受体表达的情况下,能够降低血清AngⅡ水平,降低去势雌、雄SHR大鼠的血压及心率,降低其主动脉纤维化及炎症浸润,降低其外周血及脾细胞Tc细胞亚型分化,增加外周血及脾细胞Tregs细胞亚型分化,降低T细胞中细胞因子TNF-α及IL-17表达,且这些作用部分是通过与雌、雄受体结合后实现的,能够部分被雌、雄受体拮抗剂阻断。