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近二十年来,由于对抗生素的滥用,越来越多的病原菌呈现出耐药性甚至多耐药性,人们如今已经发现几乎能耐受所有抗生素的超级细菌,然而新型有效抗生素的发掘和鉴定速度却日趋减缓。随着近十年基因组测序技术的飞速进步,越来越多的微生物基因组序列得到揭示,生物信息分析证明其中的绝大部分生物合成基因簇尚未得到充分挖掘,天然产物仍存在发现新的活性化合物的巨大潜力。体外克隆和编辑生物合成基因簇一方面可以避免原始菌株艰巨繁琐的遗传操作系统建立过程,另一方面有助于极大地推进无法在实验室条件下培养菌株或无法表达出目的化合物的基因簇的研究工作。因此该类技术对于充分挖掘生物合成基因簇潜力有着重要作用,同时对于新型高效的体外基因簇克隆和编辑工具的现实需要显得尤为迫切。成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)系统是广泛存在于原核生物中的一种获得性免疫防御机制,它能够帮助宿主细胞抵抗外来移动遗传物质(mobile genetic elements,MGEs)的侵袭。其中Ⅱ型 CRISPR/Cas9 系统则因效应元件少、作用高效、操作方便等优点得到了科研人员的广泛研究和关注。而来自Streptococcus pyogenes的CRISPR/SpyCas9系统因其研究时间早、机制理解透彻、改造方便等特点而在研究工作中使用最广。SpyCas9是一种RNA引导的核酸内切酶,利用RNA与DNA的碱基互补配对的方式赋予SpyCas9靶向特异识别并切割目标DNA双链的功能。因其仅需要SpyCas9蛋白、成熟的crRNA和含有合适靶向序列以及PAM序列的DNA底物,共三个元件即可发挥靶向识别切割的生物学功能,人们已经将之发展成一类重要的基因组研究工具,并成功应用于几乎所有模式生物。因此,本研究旨在应用此系统,在体外发展和建立新型高效的基因簇克隆和编辑的策略和工具。首先,为了能够在体外建立新型高效的基因簇克隆和编辑工具,本研究首先建立和优化了 CRISPR/SpyCas9体外酶切的体系,为后续研究工作提供了基本的技术基础。随后,利用已经建立的CRISPR/SpyCas9体外酶切技术与近年兴起的Gibson assembly高效组装技术相结合,成功建立了 SpyCas9-Gibson assembly(CGA)联用策略,成功以Enterobacter agglomerans PB-6042基因组DNA为直接来源,一步克隆获得AgglomerinA生物合成基因簇,并通过异源表达和发酵检测,进一步证实该策略的可行性。同时,为了提高大片段基因簇的克隆效率,提出了 CGA多步克隆策略(Multi-steps CGA),通过合理的设计多次使用CGA策略,从海洋来源希瓦氏菌Shewanella psychrophila WP2基因组DNA为直接来源,克隆获得未知Tetronate类次级代谢产物生物合成基因簇。为大片段或不连续基因簇克隆提供了有效的体外克隆策略。为了进一步优化CGA多步克隆策略,简化实验流程,提高大片段DNA克隆效率,本研究还将CRISPR/SpyCas9体外酶切技术与酵母转化介导重组(Transformation-associated Recombination,TAR)克隆技术联用,成功建立了SpyCas9-TAR克隆联用策略。通过合理的设计,显著提高了 TAR克隆效率。并于体外利用两个Micromonospora inyoensis DSM46123基因组cosmid成功实现了完整Sisomicin生物合成基因簇的组装克隆。为精确高效克隆高G+C%基因簇提供了新的策略。同时首次通过完整Sisomicin生物合成基因簇的异源表达和产物检测,观察到了 Gentamicin中间体A及Sisomicin终产物的产生,为Sisomicin生物合成途径的研究提供了便利。通过对SpyCas9酶切后修剪作用机制的探究,证明SpyCas9酶切后在不含PAM序列的非互补链上的3’→5’外切酶修剪机制不仅存在于线性DNA中,同时也存在于超螺旋质粒DNA中。随后分析了 sgRNA引导SpyCas9酶切后修剪的所有方向性组合,及其对靶向产物DNA末端的影响,并证实了大部分的sgRNA的设计组合均会影响后续精确编辑。为了减轻非适当sgRNA组合设计对后续精确编辑的不利影响,本研究选择使用T4DNA聚合酶对DNA末端予以处理,实验证实该处理可以显著提高靶向编辑的精确度。基于此,本研究进而提出并建立了体外高效 CRISPR/SpyCas9 靶向编辑(In vitro CRISPR/SpyCas9 Editing,ICE)策略,并在大小分别为20 kb和38 kb的质粒pYH285和10A3中成功进行了靶向同框基因敲除,同时还在pYH285质粒中顺利进行了靶向同框敲入。为大片段基因簇体外编辑提供了新型高效精确的研究工具。