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肿瘤的血管生成是肿瘤生长、侵袭、转移过程中的关键限速步骤,受到多种促血管生成因子及抑血管生成因子精确而复杂的调控。作为Eph家族的重要成员,ephrin-A1/EphA2已被证实在乳腺癌、Kaposi肉瘤、舌癌等多种肿瘤组织中明显过表达,并且与肿瘤微血管密度及患者预后密切相关。但是,ephrin-A1/EphA2调控肿瘤血管生成的具体分子机制目前仍不是十分清楚。在肿瘤血管生成过程中,各种血管生成调节因子并非独立发挥作用,而是彼此之间存在着对话效应或协同作用。血管内皮细胞中的eNOS/NO不仅是调控血管张力和通透性的重要分子,而且还在肿瘤血管生成的一系列信号激活通路中充当了关键的效应分子。eNOS/NO是否也在ephrin-A1/EphA2促血管生成中扮演了主要信号分子的角色,目前尚未见相关报道。低氧是肿瘤微环境最重要的特征之一。研究证实,低氧可通过上调多种血管生成因子的表达而促肿瘤血管生成；ephrin-A1作为低氧可诱导基因,与肿瘤血管生成关系密切,但是其具体机制仍未完全阐明。本研究通过观察低氧对肿瘤细胞ephrin-A1表达及分泌的影响,检测ephrin-A1/EphA2与eNOS/NO的交互对话效应及其信号转导途径,试图揭示ephrin-A1在肿瘤微环境中诱导血管生成的一种新机制。第一部分eNOS/NO在ephrin-A1促HUVECs血管生成中的作用目的：在体外验证ephrin-A1的促血管生成活性,明确eNOS/NO在ephrin-A1促HUVECs血管生成中的作用。方法：采用重组人ephrin-A1蛋白(ephrinA1-Fc)作为刺激因素,观察其对原代培养的HUVECs迁移、成管及增殖能力的影响；Griess法测定HUVECs上清液中NO的含量；运用eNOS特异性阻断剂L-NAME行阻断实验,观察L-NAME对ephrin-A1促HUVECs迁移、成管活性的影响。结果：细胞划痕实验结果显示,HUVECs经干预后24小时,ephrinA1-Fc组划痕面积明显缩小,阴性对照组(C组)及对照组(Fc组)划痕虽也有所关闭,但是不如ephrinA1-Fc组明显,统计分析表明,ephrinA1-Fc组的划痕关闭率较对照组明显高(P<0.05),说明ephrinA1-Fc在体外具有促进HUVECs迁移的活性。细胞增殖实验结果显示,HUVECs的活力及增殖情况良好,ephrinA1-Fc组与C组比较并无明显差异(P>0.05)。成管实验结果显示,经刺激6小时后,ephrinA1-Fc组HUVECs在BD matrigel上伸展充分,相互连接成完整的管状结构,且分布较为均匀,而C及Fc组内皮细胞伸展较差,伪足较短,有小片状聚集现象,完整管状结构较少,且分布明显不均；对每孔所有管状结构内皮细胞分叉点的计数统计结果表明,ephrinA1-Fc组分叉点较C及Fc组明显多(P<0.05)。对细胞上清液的NO检测结果显示,经刺激24小时后,ephrinA1-Fc组细胞上清液的NO含量为42.1±4.1μM,而C组的NO含量仅为10.4±3.4μM,两组之间比较有显著统计学差异(P<0.05)。阻断实验结果显示,当加入L-NAME (100μM)后,ephrinA1-Fc的促HUVECs迁移作用明显被逆转,ephrinA1-Fc+L-NAME组的划痕关闭率较ephrinA1-Fc组明显降低(P<0.05)。成管实验中,ephrinA1-Fc+L-NAME组HUVECs伪足伸展明显差,未见完整管状结构形成,而单纯ephrinA1-Fc组内皮细胞伪足伸展充分,形成多数完整管状结构,分布较均匀；对管状结构内皮细胞分叉点计数的统计分析表明,加入L-NAME后,HUVECs的成管率显著降低(P<0.05)。结论：Ephrin-A1可通过增加HUVECs的迁移及成管能力而促进血管生成,对细胞增殖的影响并不明显；eNOS/NO参与介导了ephrin-A1的促血管生成过程,二者之间可能存在交互对话效应。第二部分PI3K/Akt信号通路在ephrin-A1/EphA2与eNOS/NO交互对话中的作用目的：探讨ephrin-A1诱导血管生成过程中eNOS激活及NO合成增加的潜在机制：重点关注PI3K/Akt信号通路在ephrin-A1/EphA2与eNOS/NO交互对话中的作用。方法：采用细胞免疫荧光、实时定量PCR、Western Blot等方法,观察ephrin-A1刺激HUVECs后eNOS蛋白表达的变化情况；运用针对eNOS、Akt相应氨基酸位点的特异性磷酸化抗体,观察ephrin-Al对P-eNOSSer1177、P-AktSer473表达的影响；采用PI3K特异性阻断剂LY294002,观察LY294002对P-eNOSSer1177、P-AktSer473表达水平的影响,以明确PI3K/Akt信号通路在ephrin-A1诱导血管生成中的作用。结果：EphrinA1-Fc (1μg/ml)作用于]HUVECs0h-24h后,细胞免疫荧光、实时定量PCR及Western Blot结果显示,eNOS的在细胞、mRNA、蛋白水平表达量均无明显变化(P>0.05)。ephrinAl-Fc可诱导eNOS Ser1177位点发生快速磷酸化,且有明显的时间依赖性,在10min时P-eNOS ser1177表达即明显上调,在30min左右基本达到高峰,到60min时开始有所下降(P<0.05)。ephrinA1-Fc刺激后,P-AktSer473表达也明显上调,其表达趋势与P-eNOS Ser1177基本一致。阻断实验结果显示,LY294002不仅可明显抑制ephrinAl-Fc诱导的P-Akt Ser473表达上调,还可以同时下调P-eNOS ser1177的表达(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,ephrinAl-Fc+LY294002组的划痕面积在实验终点时较单纯ephrinA1-Fc组明显大,细胞迁移速度减慢,划痕关闭率明显降低(P<0.05)；成管阻断实验结果显示,ephrinA1-Fc+LY294002组HUVECs在基质胶上伸展不充分,完整的管状结构较ephrinA1-Fc组明显减少,对管状结构分叉点计数的统计分析表明,ephrinA1-Fc+LY294002组分叉点数目显著低于ephrinAl-Fc组(P<0.05)。结论：Ephrin-A1诱导的HUVECs NO合成增加,主要由P-eNOSSer1177表达上调引起；PI3K/Akt/eNOS/NO信号轴参与介导了ephrin-A1的促HUVECs血管生成过程。第三部分低氧对口腔癌细胞膜偶联型及分泌型ephrin-Al表达的影响目的：明确低氧对口腔癌细胞SCC-9膜偶联型及可溶性ephrin-A1表达的影响,同时在体外验证其生物学活性。方法：采用1%02,94%N2,5%CO2作为低氧条件对SCC-9细胞进行干预,Western Blot检测细胞ephrin-A1的表达变化情况：收集细胞上清液,检测SCC-9可溶性ephrin-A1的分泌情况；通过U-251细胞变圆实验,验证可溶性ephrin-A1的生物学活性。结果：Western Blot结果显示,ephrin-A1在SCC-9细胞系中呈阳性表达；ephrin-A1表达有明显时间依赖性,0-12h ephrin-A1表达量逐渐升高,在12-24h时达到高峰,之后表达量逐渐下降；低氧组SCC-9细胞各时间点ephrin-A1的表达均较常氧组明显增高。细胞上清液中可溶性ephrin-A1检测结果显示,常氧组及低氧组SCC-9细胞上清液中ephrin-A1均呈阳性表达；可溶性ephrin-A1在细胞上清液中的含量呈累积效应,随时间延长,含量逐渐增多；低氧组可溶性ephrin-A1表达量在各时间点均较常氧组明显上调。细胞变圆实验结果表明,ephrinAl-Fc可诱发U-251明显的形态学改变,在干预后15min细胞即开始出现明显皱缩变圆,到30min时达到高峰,其后细胞逐渐伸展开来,到2h时形态基本恢复正常；常氧组及低氧组条件培养液也可以诱导U-251细胞发生相同的细胞形态学变化过程,在刺激后15min细胞开始出现明显皱缩变圆,到30min时达到高峰,其后细胞逐渐恢复正常。结论：Ephrin-A1可从肿瘤细胞表面分泌到细胞外环境中；低氧可上调肿瘤细胞ephrin-A1的表达并增加可溶性ephrin-A1的释放：可溶性ephrin-A1仍保持了其生物学功能。综合所有实验结果,我们认为：在肿瘤微环境中,低氧诱导表达的膜偶联型及可溶性ephrin-A1很可能通过邻分泌和／或旁分泌的途径,将信号进一步传递到内皮细胞,激活内皮细胞的EphA2受体而引发PI3K/Akt/eNOS/NO信号通路的级联反应,最终诱导肿瘤血管生成。