芥子酸通过TGF-β1/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的LX2细胞纤维化

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研究目的:肝纤维化是对肝脏慢性损伤的病理性修复,是慢性肝病发展的根本过程。肝星状细胞的活化是肝纤维化核心事件,激活的肝星状细胞可迁移至损伤处,分泌细胞外基质促进纤维瘢痕的产生。芥子酸是中草药中常见的有效成分之一,属于酚酸类物质,被认为是一种重要的断链抗氧化剂,具有良好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化活性。本研究旨在探讨芥子酸对肝纤维化的影响及潜在分子机制,为探寻有效的肝纤维化治疗药物提供理论依据及实验基础。方法:1.以肝星状细胞(LX2)为研究对象,通过MTS法检测给予不同浓度芥子酸的 LX2 细胞 OD 值,设置对照组、5μmol/L 组、10μmol/L 组、20μmol/L 组、40μmol/L组、80μmol/L组、100μmol/L组,应用公式:细胞存活率=(给药组OD值/对照组OD值)× 100%,计算细胞存活率;2.应用 RT-qPCR 检测,观察给予 5ng/ml TGF-β1 组、10ng/ml TGF-β1 组 LX2细胞α-SMA、COL-1 mRNA表达情况,分别与对照组进行比较;3.应用 Western blot 法,观察 5ng/ml TGF-β1 组、10ng/ml TGF-β1 组 LX2 细胞α-SMA、COL-1、Fibronectin蛋白表达情况,分别与对照组进行比较;4.选取适宜浓度TGF-β1刺激LX2细胞,设为造模组,再给予不同浓度的芥子酸设为给药组,应用RT-qPCR法,观察对照组、造模组、低剂量给药组、高剂量给药组α-SMA、COL-1 mRNA表达情况;5.选取适宜浓度TGF-β1刺激LX2细胞,设为造模组,再给予不同浓度的芥子酸设为给药组,通过Western blot法,观察对照组、造模组、低剂量给药组、高剂量给药组α-SMA、COL-1、Fibronectin蛋白表达情况;6.选取适宜浓度TGF-β1刺激LX2细胞,设为造模组,再给予不同浓度的芥子酸设为给药组,应用Western blot法,观察芥子酸在TGF-β1/Smad信号通路中pSmad2、pSmad3蛋白的表达情况。结果:1.MTS实验测定LX2细胞活力,显示不同浓度的(5、10、20、40、80、100μ/L)芥子酸对LX2细胞均无毒性作用。2.通过RT-qPCR法测定不同浓度的(5、10ng/ml)TGF-β 1可促进LX2细胞纤维化相关基因的mRNA表达,与对照组相比,纤维化相关基因α-SMA、COL-1 mRNA表达上调(P<0.001)。3.通过Western blot法,表明不同浓度的(5、1Ong/ml)TGF-β1可刺激LX2细胞表达纤维化相关蛋白(α-SMA、COL-1、Fibronectin),与对照组相比蛋白表达量增加(P<0.001)。4.RT-qPCR实验结果显示,与造模组相比,给予低剂量(20μmol/L)芥子酸组和高剂量组(40μmol/L)纤维化相关基因α-SMA mRNA表达下调(P<0.01);给予低剂量(20μmol/L)和高剂量(40μmol/L)芥子酸组COL-1 mRNA表达下调(P<0.01,P<0.001)。5.Western blot法显示,与造模组相比,给予低剂量(20μmol/L)芥子酸组和高剂量组(40μmol/L)α-SMA、COL-1表达量减少(P<0.001);与造模组相比,Fibronectin 低剂量组(20μmol/L)表达量增加(P>0.05);Fibronectin 高剂量组(40μmol/L)表达量减少(P<0.001)。6.Western blot实验结果显示,与对照组相比,造模组TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白Smad2、Ssmad3磷酸化水平升高(P<0.001);与造模组相比,不同浓度(20、40μmol/L)给药组 Smad2(P<0.001)、Ssmad3(P<0.05,P<0.01)蛋白磷酸化水平降低。结论:芥子酸抑制TGF-β1诱导的LX2细胞纤维化相关基因和蛋白的表达,表明芥子酸具有抗纤维化作用。芥子酸抗肝纤维化的机制与TGF-β1/Smad信号通路中Smad2和Smad3蛋白磷酸化水平受抑制相关。
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