组织工程微组织修复大鼠跟腱损伤的实验研究

来源 :泰山医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tanner007
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目的探讨大鼠尾腱细胞外基质制备方法,并将其与脂肪间充质干细胞共培养构建肌腱微组织,用于修复大鼠跟腱损伤并评价这种生物材料修复肌腱损伤的效果,为临床上治疗肌腱损伤提供动物实验研究基础。研究方法体外实验:取20只150-200gSD大鼠鼠尾作为实验材料,分别抽取出大鼠尾腱,经PBS彻底清洗后反复冻融3次,然后经过1%SDS于室温下处理24小时,并用大量PBS清洗1周除去细胞残渣,最后钴60消毒备用。对制备的大鼠尾腱细胞外基质进行病理学染色,观察细胞残留情况。同时,检测该来源的生物源性材料残留α-Gal含量。此外,将制备的大鼠尾腱细胞外基质复合脂肪间充质干细胞观察该种材料对细胞生长增殖的影响。同时,用CCK8试剂盒检测这种生物材料的细胞毒性。体内实验:将制备好的大鼠尾腱细胞外基质复合脂肪干细胞培养,7天后填充在大鼠跟腱横断处用于促进肌腱的修复。在2周时取材进行PCR检测观察ColⅠ、ColⅢ、FBN、VEGF、TNMD等相关因子的表达。在4周、8周取材,进行大体观察、病理染色、力学检测、步态检测以及影像学观察,评价该种生物材料对大鼠跟腱损伤的修复效果。结果体外实验:大体观察可见,经脱细胞处理过的尾腱体积增大,呈乳白色匀浆状。HE以及DAPI染色结果显示,经脱细胞处理后的尾腱细胞核大量减少,细胞数量显著降低,每个高倍镜视野内细胞残余量不大于5个。脱细胞尾腱残留α-Gal含量与正常尾腱相比有统计学差异,脱细胞尾腱残留DNA极少。复合脂肪间充质干细胞培养7天后相比1天活细胞数量明显增多。CCK-8毒性测试结果显示这种脱细胞大鼠尾腱的生物相容性较好,没有细胞毒性。体内实验:2周时PCR结果显示:在微组织组中ColⅠ、ColⅢ、TNMD表达高于对照组,但VEGF表达低于对照组,同时FBN表达无明显差异;4周时,微组织组新生肌腱表面光滑有光泽,HE及Masson染色显示组织连续性良好,各组均表现不同程度的炎性反应,微组织组较其他组轻,组织间可见胶原纤维增生以及新生血管生成;8周时,各组炎性反应都有不同程度的减轻,在微组织组胶原纤维排列较之前更有序,各组新生毛细血管均减少。与对照组相比,微组织组胶原纤维排列致密,细胞呈梭型,排列有规律。力学结果显示:各组的最大载荷分别为:正常组63.95±4.42N,空白组25.14±6.17N,细胞组37.34±4.01N,微载体组46.29±3.25N,微组织组56.77±7.69N;抗拉强度分别为:正常组5.09±0.35MPa,空白组0.65±0.16MPa,细胞组1.90±0.20 MPa,微载体组1.20±0.08 MPa,微组织组4.52±0.61 MPa。步态结果显示:2周时,微组织组平均足印强度均大于对照组平均足印强度,但是与微载体组相比无统计学差异。4周、8周时,微组织组平均足印强度与对照组相比差异均有统计学意义;在2周时,微组织组平均足印面积大于空白组,差异具有统计学意义,但是与微载体组以及细胞组没有差异。在4周和8周,微组织组平均足印面积也大于对照组,差异有统计学意义。B超结果显示:4周时,各对照组出现不同程度的组织排列紊乱、组织水肿以及炎性反应。微组织组显示跟腱连续性尚可,较空白组以及细胞组明显改善,可见跟腱体积稍增大,轮廓模糊。8周时,对照组组织水肿以及炎性反应有所减轻,但组织排列依旧紊乱。微组织组跟腱连续性较好,组织排列有序,B超表现为平行的细条状强回声间以少许细条状低回声。结论(1)经过本实验脱细胞方法制备的大鼠尾腱细胞外基质可有效除去细胞成分,并且与脂肪间充质干细胞有较好的生物相容性,可作为一种生物材料用于肌腱损伤修复。(2)该种生物材料复合脂肪干细胞形成的肌腱微组织能够促进大鼠损伤跟腱的愈合,对肌腱损伤修复的研究有一定的参考价值。
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