研究背景21世纪初,恶性肿瘤仍是危害人类健康最严重的一类疾病。在人类死亡病因中,癌症位居第一,并且其发病率仍在上升。据世界卫生组织(WHO)报道,全世界每年约有1000万人死于恶性肿瘤,不仅恶性肿瘤的发病率在上升,而且在发病年龄上日趋年轻化。如何有效的预防和治疗癌症,成为医学界关注的重要课题之一。抗肿瘤药物的研究一直是医学研究的热点,药物的作用机制主要包括：1、诱导肿瘤细胞凋亡；2、细胞毒作用；3、抑制肿瘤细胞的增殖；4、抑制肿瘤细胞的侵袭和转移等。自从八十年代初Folkman提出肿瘤生长依赖新血管生成的理论,阻断肿瘤血管生成、切断肿瘤组织获得营养途径已经成为新的抗肿瘤治疗靶点,而且也成为抗肿瘤治疗中热门的研究内容。目前已证实的血管生成调控因子,可分为血管生成因子和血管生成抑制因子两类。而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作为一种诱导血管形成的血管生长因子,在血管生成过程中起核心作用。在恶性肿瘤的病理中,细胞对低氧的适应和血管生成是肿瘤发展过程中的关键步骤之一。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,是主要的氧调节亚基和功能亚基,在肿瘤的氧反应过程中HIF-1α起着中枢纽带的作用。促血管生成因子中最重要的是VEGF,能增加血管的通透性,促进内皮细胞的迁移、增生和肿瘤新生血管的生成,促进肿瘤的生长和侵袭、转移。国内外研究表明,VEGF通过旁分泌和自分泌机制从而促血管生成、促进肿瘤细胞生长侵润和转移,其在大多数肿瘤细胞内呈高表达。已有的研究表明,随着肿瘤体积的不断快速增大,肿瘤便进入了缺氧状态,从而使大量HIF-1α积聚。增多的HIF-1α就会与其下游携带有低氧反应元件(HRE)特异区域的靶基因结合使其表达增强,其中VEGF就是其靶基因中最重要的一种因子。因此,对于"HIF-VEGF-血管生成”途径的研究,具有十分重要的意义。在祖国医学理论中,癌病是多种恶性肿瘤的总称。癌病的发生是在脏腑阴阳气血失调的基础上,六淫邪毒入侵,并与气、痰、湿、瘀、热等搏结积聚而成。中药治疗肿瘤有多种不同的治则。行气化痰、活血化瘀、清热解毒、补益气血、利水渗湿等类中药均具有不同程度的抑癌作用。而今随着分子生物学技术的发展及中医现代化的进展,中药单体和复方在抗肿瘤血管生成的实验研究中取得了长足的进展,如姜黄、川芎、全蝎、壁虎、鳖甲煎丸、参麦注射液、当归补血汤等均已证明具有很好的抑制血管生长的作用。散结抗瘤方是导师陈达理教授根据多年的临床实践,总结出来的中药抗癌复方,我们临床上观察到它对各种实体瘤具有良好的疗效,且先前的实验研究已经证明：该方抑瘤作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。散结抗瘤方以消癥化积、软坚散结、以毒攻毒为主要功效,由浙贝、法夏、蜈蚣、夏枯草、白花蛇舌草等8味药组成。关于这类药的抗肿瘤作用已有很多文献报道。本实验以S180移植性肉瘤小鼠为研究对象,观察该复方对VEGF和HIF-1α表达的调控,探求该方抑制肿瘤血管生成的可能作用靶点。在中医药抗肿瘤的体内实验研究中,建立恶性肿瘤动物模型一般来说分为三种：自发肿瘤模型、诱发肿瘤模型和移植肿瘤模型。移植肿瘤模型是目前研究最多的肿瘤模型,容易人为操作,动物成瘤稳定,均一性好,发病率高,成瘤时间差异不大,容易施加干扰因素等。该模型不能用于病因学、癌前病变和癌变的研究,但对成瘤、治疗、浸润和转移等研究非常有用。本实验选用S180可移植性肿瘤细胞株,成功造成移植肿瘤模型。目前此模型已广泛的应用于肿瘤基础研究及药物筛选,成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。研究目的观察散结抗瘤方对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫器官的影响,并通过免疫组化方法检测VEGF、HIF-1α的表达,来探讨其抗血管生成作用的机制,为临床应用提供基础的实验依据。研究方法建立小鼠移植S180肉瘤模型：体外复苏培养S180细胞,在细胞的指数生长期收集细胞,用无菌生理盐水稀释,调整到2-3×106/ml。随机选取10只健康SPF级昆明小鼠,每只用上述细胞悬液0.4ml腹腔注射,约1周后接种小鼠腹部明显涨大、凸出,将小鼠颈椎脱臼处死,超净台内无菌抽取乳白色腹水液,用生理盐水稀释,调整细胞数为1-2×107/ml,取0.2ml于每只小鼠右上肢腋窝消毒后皮下接种。瘤细胞悬液接种前,均用0.2%台盼蓝染色,计算活细胞数为95%-98%。从抽取腹水开始,到接种完最后1只小鼠的总时间控制在1h内。随机将接种后的小鼠分为荷瘤对照组、环磷酰胺(CTX)组、散结抗瘤方组、散结抗瘤方加CTX组(联合组)。每组10只。荷瘤对照组给予蒸馏水0.5ml灌胃,生理盐水0.2ml腹腔注射；环磷酰胺组给予蒸馏水0.5ml灌胃,环磷酰胺20 mg/kg腹腔注射；散结抗瘤方组(根据人与小鼠药物剂量换算公式计算)相应剂量灌胃,生理盐水0.2ml腹腔注射；散结抗瘤方加CTX组(联合组)散结方药液相应剂量灌胃,环磷酰胺20mg/kg腹腔注射。实验过程中每3天称1次体重,根据体重计算相应的给药量。用药后注意观察动物的一般情况。各组连续给药15天。停药次日称重并处死小鼠,解剖剥离瘤块,称重计算均值,计算肿瘤抑制率；同时取出小鼠的脾脏和胸腺,称其重量,计算脾脏、胸腺指数。肿瘤组织用10%中性甲醛固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片,HE染色,光镜观察肿瘤组织的病理改变。采用免疫组化SP法检测各组荷瘤小鼠肿瘤组织的VEGF、HIF-1α的表达强度。研究结果1、荷瘤对照组肿瘤生长较快,并且小鼠饮食减少,毛发杂乱无光泽,竖毛现象明显；其他各组肿瘤生长相对缓慢,散结抗瘤方组和联合组小鼠明显比荷瘤对照小鼠活泼,皮毛有光泽,竖毛现象不明显；环磷酰胺组小鼠状况最差。2、散结抗瘤方、环磷酰胺组、联合组的瘤重与荷瘤对照组相比差异显著(F=52.692,P=0.000)；且联合组的瘤重明显低于散结抗瘤方组和环磷酰胺组(P<0.05)。单独应用散结抗瘤方和环磷酰胺的抑瘤率分别为30.26%和51.55%,而在相同条件下,联合用药组抑瘤率为71.14%,按照金氏公式求的q值为1.08,表明两药联合应用具有协同作用。3、散结抗瘤方组的胸腺指数、脾脏指数较荷瘤对照组和环磷酰胺组有显著性提高,差别具有统计学意义(P<0.05)；与环磷酰胺组比较,联合组的胸腺指数和脾脏指数均有显著性提高(P<0.05)。4、HE染色切片可见：荷瘤对照组肿瘤细胞排列较密集,瘤组织内小血管较丰富。各给药组均可见不同程度的片状坏死区,瘤组织及其周围新生微血管减少,其中以联合组最为显著。5、各组小鼠肿瘤组织中VEGF和HIF-1α蛋白的表达：与荷瘤对照组比较,其余实验各组的VEGF、HIF-1α蛋白的表达均明显降低(F=54.982,P=0.000；F=88.759,P=0.000)。与散结抗瘤方组比较,环磷酰胺组的VEGF和HIF-1α的表达显著降低(P<0.05)。6、HIF-1α与VEGF表达的相关性：Spearman等级相关分析结果显示,HIF-1α的表达与VEGF表达之间呈正相关(r=0.806,P=0.000)。研究结论散结抗瘤方可以改善荷瘤小鼠的生存状态；同时可以抑制肿瘤生长,且与CTX有协同作用。散结抗瘤方有减除肿瘤对宿主免疫器官的损害和抑制作用,且可提高宿主的免疫功能。散结抗瘤方可以抑制小鼠肿瘤组织的VEGF、HIF-1α的表达,且HIF-1α和VEGF之间正相关,由此提示HIF-1α可能参与了散结抗瘤方的抗血管生成,通过下调肿瘤细胞中HIF-1α蛋白表达,进而抑制其下游靶基因VEGF的蛋白表达,可能是该复方抗血管生成的重要机制。