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目的建立雄性大鼠生殖系统热应激模型,研究急性热应激对附睾精子成熟微环境的影响:利用蛋白质组学技术鉴定附睾热应激相关蛋白表达谱,探讨热应激对于附睾早期微环境的影响,为附睾精子成熟和男性避孕研究提供实验依据。方法1.将47只大鼠分成三部分:取3只大鼠构建大鼠附睾(头)蛋白表达谱;取12只大鼠分成4组:正常对照组、42℃30min组、42℃60min组和42℃120min组,每组3只,做精子活力分析;取32只雄性SD大鼠(300-400g)分成两组,热应激组和对照组各16只。通过将大鼠的睾丸浸泡于42℃水浴中温浴不同时间建立热应激模型;对照组将大鼠于室温水浴中建立对照组。2.利用精子分析仪对精子活力进行分析;3.HE染色后光镜下观察附睾组织的形态学变化。4.蛋白质组学平台上:利用二维凝胶电泳分离热应激和对照组蛋白,建立蛋白表达谱,然后再用Image Master 2D Flatinum软件对凝胶进行扫描并寻找表达上调与下调的蛋白胶点,最后取胶点脱色溶出凝胶蛋白,点靶后用通过5800 MALDI-TOF/TOF质谱仪鉴定表达蛋白,建立差异附睾头蛋白表达谱和热应激相关差异蛋白表达谱;综合利用生物信息学工具(Gene Ontology,PIR,DAVID)分析差异蛋白分子生物学功能和参与的分子生物学过程。5.分别选取热应激后的上调蛋白和下调蛋白中关键的差异蛋白,进行免疫组化和蛋白印迹法验证。6.细胞凋亡法检测附睾组织经过热应激后的凋亡情况。结果1.精子活力分析显示42℃水浴时间超过60min时大鼠的精子活力开始明显下降,本研究选择温浴60min建立大鼠附睾热应激模型。2.通过蛋白质组学建立了大鼠附睾头部蛋白表达谱,鉴定出150个蛋白;热应激相关差异蛋白点鉴定出92个,利用MALDI-TOF/TOF质谱共鉴定非冗余差异蛋白21个,其中热应激相关上调蛋白11个,下调蛋白10个。3.HE染色显示热应激组的附睾组织相对于对照组没有明显的形态学变化,但热应激组出现附睾上皮组织细胞核空泡化。4.免疫组织化学和蛋白印迹法证实了Prdx6和Clu在热应激组表达显著下降,SOD1在热应激组表达增高的差异表达趋势。5.细胞凋亡检测发现热应激组细胞凋亡明显增加。结论构建了大鼠附睾急性热应激模型,通过蛋白质组学鉴定了热应激相关蛋白表达谱,并验证了热应激对附睾蛋白表达的影响以及引起附睾微环境的变化,为附睾生理功能和精子成熟研究提供了有用的信息。