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猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus Coronavirus,PDCoV)是自2012年以来新发现的冠状病毒。猪丁型冠状病毒是肠道性病原体,各个年龄段的猪均易感,但主要引起仔猪的腹泻、呕吐、脱水;临床症状和PEDV和TGEV比较相似,但死亡率(30%-40%)比后两个引起的死亡率低,常伴随与PEDV和TGEV的混合感染。被感染的猪只病理发现小肠中有黄色液体、肠壁变薄、透明,病理组织学显示小肠绒毛细胞大量萎缩,自暴发流行以来,给养猪业带来了巨大的损失。虽然PDCo V流行趋势很大,但其来源我们不得而知。猪感染早期病毒含量比较低,本研究根据PDCoV的N基因成功建立一套套式PCR检测方法。利用套式PCR检测方法对广东省2012-2016年采集的420份猪腹泻病料进行流行性病学检测,结果显示PDCoV的阳性率为13.33%,PDCo V/PEDV混合感染率为5.95%。将PDCoV阳性样品接种LLC-PK细胞成功分离出一株猪丁型冠状病毒,命名为PDCoV/CHGD/2016。对分离毒株进行全基因扩增和遗传进化分析,基因测序显示PDCo V/CHGD/2016全基因组长度为25419bp。全基因同源性分析显示PDCoV/CHGD/2016与3个中国毒株(PDCoV/CHJXNI2/2015、CHN-JS-2014、CHN-HB-2014)的同源性最高,达到99.4%,与两个泰国毒株的同源率最低,为97.4%;S蛋白同源性分析显示,PDCoV/CHGD/2016与其他猪丁型冠状病毒毒株间的同源率为95.9%-99.3%,其中与PDCoV/CHJXNI2/2015同源率最高,与泰国毒株的同源性最低。与HKU-155和CHN-AH-2004相比,PDCoV/CHGD/2016在3’端非编码区有三个碱基GTT的插入。全基因序列和S蛋白序列系统进化树结果表明,PDCoV/CHGD/2016与猪丁型冠状病毒形成一个小的分支,亲缘关系相近,而与鸟丁型冠状病毒亲缘关系较远。采集感染PDCoV的仔猪的小肠进行HE染色,观察PDCoV引起的病理组织变化,结果显示主要引起小肠绒毛的萎缩,证实PDCoV是典型的肠道型病原体。这些研究为以后猪丁型冠状病毒的诊断防控、病毒学研究、致病性、流行性及分子生物学研究提供理论支持和数据分析。为了建立一套快速、灵敏、精准、方便的检测诊断方法,本研究根据PDCo V的保守基因N设计引物建立PDCoV实时荧光定量PCR检测方法。建立的标准曲线显示循环阈值与模板浓度线性关系良好。对不同病毒进行扩增,结果只有PDCo V的阳性标准品有荧光信号,而TGEV、PEDV、PRRSV、RV和阴性对照均无扩增曲线出现,表明特异性强。建立实时荧光定量PCR所能检测到的最低的拷贝数为81.4 copies/μL,比常规普通RT-PCR敏感性高出3个数量级。选取同一浓度的标准品进行6次重复,结果显示扩增出来的6条S型扩增曲线密集排列,所得的Ct值基本相同,变异很小,证明重复性好。临床样品检测试验显示实时荧光定量PCR检测出PDCoV的阳性率比常规普通RT-PCR要高。实时荧光定量PCR检测方法的建立,特异性强、敏感度高、重复性好,并且对待测样品可进行定量分析,省时省力,提高了检测效率,为PDCoV的临床诊断提供很大的方便。