烟曲霉是一种重要的机会性致病真菌,广泛存在于自然环境中,通过吸入侵入人体,在一定条件下可引起侵袭性肺曲霉病(Invasive Pulmonary Aspergillosis,IPA)。近年来,随着骨髓和实体器官移植、肿瘤化疗、糖皮质激素以及广谱抗生素等治疗手段的应用,IPA的发病率呈上升趋势,致死率较高。IPA的发生发展是宿主和病原体相互作用的结果。天然免疫是机体抵御病原侵袭的首要环节,是一切免疫应答的基础。吸入肺部的烟曲霉孢子得以被顺利清除,依靠于免疫细胞如单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞以及气道上皮细胞。肺泡巨噬细胞在肺组织局部发挥重要天然免疫效应,被称为天然免疫的前哨,能够识别、处理加工并提呈抗原信息,诱导建立特异性免疫应答。同时通过感染局部微环境的负反馈调节,发挥免疫自稳作用,避免过度的免疫损伤,维持内环境的稳定。目前,烟曲霉与机体相互作用机制尚有未明晰之处,如烟曲霉感染后引起的肺上皮细胞的变化,烟曲霉侵袭后巨噬细胞、NK细胞等天然免疫细胞之间的交互作用等。因此,通过研究烟曲霉与机体互作机制,进一步理解机体细胞在烟曲霉感染中的作用,发现关键调节分子,对为进一步控制烟曲霉感染和治疗侵袭性曲霉病提供新的靶点。一、实验方法与结果1.烟曲霉对巨噬细胞极化的作用及机制本研究以单核细胞诱导的巨噬细胞为研究对象,应用Western-Blotting、Si-RNA等实验测定巨噬细胞内信号传导通路,探讨烟曲霉刺激巨噬细胞极化的分子机制。结果发现烟曲霉肿胀孢子可刺激M1巨噬细胞极化。2.烟曲霉刺激巨噬细胞极化激活NK细胞的研究本研究将烟曲霉肿胀孢子刺激的巨噬细胞与自体NK细胞共培养,探讨NK细胞活化水平和IFN-γ分泌能力的变化。应用抗体中和实验和基因沉默实验证明烟曲霉通过刺激巨噬细胞激活NK细胞的重要分子和作用机制。结果发现烟曲霉肿胀孢子刺激M1巨噬细胞极化,通过分泌Galectin-9而增强NK细胞分泌IFN-γ和CD69表达。3.烟曲霉感染肺上皮细胞的蛋白组学研究模拟侵袭性肺曲霉病中曲霉对肺上皮细胞的作用,在体外用烟曲霉感染肺上皮细胞A549,建立侵袭性曲霉病的肺上皮细胞体外模型,采用i TRAQ技术和细胞信息学技术获得烟曲霉孢子与肺泡上皮细胞A549相互作用的蛋白组学数据,得到了与之相关的多个差异蛋白,并且发现NDRG-1和CD44会分别影响A549的内吞作用和炎性细胞因子的表达。4.相关临床研究通过收集肺曲霉病患者(IPA)支气管肺泡灌洗液和排除真菌感染的患者支气管肺泡灌洗液标本,检测巨噬细胞的极化特征和NK细胞的激活情况。结果发现侵袭性肺曲霉病患者肺泡灌洗液中的巨噬细胞以M1型巨噬细胞为主,经IL-15/18刺激后,IPA患者肺泡灌洗液中来源的NK细胞表现为更强的激活水平和IFN-γ分泌能力,与体外实验结果一致。二、实验结论1.烟曲霉肿胀孢子通过结合巨噬细胞表面的Dectin-1和Dectin-2受体,引起细胞膜内部的接头蛋白ITAM聚集,并招募大量的Syk与ITAM形成复合物,进一步引起Syk的磷酸化,磷酸化的Syk诱导下游CARD9表达的增加,与BCL10和MALT1形成三聚体,引起下游IκBα向细胞核内转移,并磷酸化,激活NF-κB信号通路,促进炎症细胞因子Galectin-9、TNF-α、IL-18的分泌和巨噬细胞的极化;同时,Syk磷酸化会激活STAT1信号通路,进一步促进M1巨噬细胞极化和炎性细胞因子分泌。2.M1巨噬细胞分泌Galectin-9增强NK细胞分泌IFN-γ和CD69表达可能是巨噬细胞调节NK细胞的机制之一。3.采用i TRAQ技术和细胞信息学技术获得烟曲霉孢子与肺泡上皮细胞A549相互作用的蛋白组学数据,发现NDRG-1和CD44会分别影响A549的内吞作用和炎性细胞因子的表达,提示肺上皮细胞对烟曲霉孢子存在一系列的反应。4.侵袭性肺曲霉病患者肺泡灌洗液中的巨噬细胞以M1型巨噬细胞为主,经IL-15/18刺激后,IPA患者肺泡灌洗液中来源的NK细胞表现为更强的激活水平和IFN-γ分泌能力,从临床患者角度再此证明了曲霉感染时巨噬细胞对NK细胞具有调节作用。综上所述,本研究探讨了烟曲霉孢子刺激巨噬细胞极化的作用及其在巨噬细胞与NK细胞间相互作用的机制,并获得烟曲霉孢子作用于肺泡上皮细胞A549的蛋白组学数据及关键分子。为进一步理解烟曲霉作用于机体的机制、以及曲霉病防治提供一定的理论依据和实验支撑。