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目的:通过不同辅料炮制的淡豆豉中大豆异黄酮HPLC指纹图谱及含量变化,比较不同辅料对淡豆豉炮制过程的影响,揭示淡豆豉的炮制机理。在此基础上,建立淡豆豉样品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素多指标成分含量测定的方法,为科学评价与有效控制河北产淡豆豉药材的质量提供科学依据。方法:1指纹图谱的建立:(1)提取:比较了不同提取溶剂、不同提取方法及不同提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件,并对提取物进行纯化。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测波长,调整流动相的组成、配比,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中染料木苷峰的分离度和理论板数。(4)稳定性试验:取样品溶液分别于0,4,8,12,24,48h进样,记录保留时间和峰面积。(5)精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,记录保留时间和峰面积。(6)重复性试验:取同一批淫羊藿炮制淡豆豉药材6份,平行制备样品溶液,进样,记录保留时间和峰面积。(7)指纹图谱的建立:分别取不同批次的不同辅料炮制的淡豆豉和黑豆样品,制备供试品溶液,进行指纹图谱分析。(8)炮制辅料图谱的建立:分别取淫羊藿、青蒿、桑叶药材,制备供试品溶液,进样,得到各药材图谱。2总异黄酮成分的含量测定:(1)测定波长的确定:取对照品溶液及供试品溶液适量,以相应试剂作空白,照紫外-可见分光光度法,在200~800nm波长范围内进行光谱扫描,考察最大吸收波长。(2)标准曲线的绘制:配制系列浓度的染料木素对照品溶液,分别测定吸收度,以吸收度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。(3)稳定性试验:取样品溶液放置0,4,8,12,24,48h后测定吸收度。(4)精密度试验:取同一份样品溶液,重复6次,测定吸收度。(5)重复性试验:取同一批次淫羊藿炮制淡豆豉药材,平行制备样品溶液6份,分别测定吸收度。(6)回收率试验:取已知总异黄酮含量的药材适量,分别加入适量的染料木素对照品溶液,各平行制备三个不同浓度,每个浓度的样品分别平行3份,测定总异黄酮的含量。(7)样品测定:在上述条件下,测定10批河北产不同辅料炮制淡豆豉及黑豆原料中大豆异黄酮的含量。3四种大豆异黄酮成分的含量测定:(1)标准曲线的绘制:配制系列浓度的染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元对照品溶液,分别进样,测定峰面积;以染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元的含量为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线。(2)稳定性试验:取样品溶液分别放置0,4,8,12,24,48h后进样,测定峰面积。(3)精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,测定峰面积。(4)重复性试验:取同一批次淡豆豉药材平行制备样品溶液6份,分别进样,测定峰面积。(5)回收率试验:取已知大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的淡豆豉药材适量,分别加入适量的大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品溶液,各平行制备三个不同浓度,每个浓度的样品分别平行3份,测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。(6)最低检测限的确定:将大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为最低检测限。(7)样品测定:在上述色谱条件下,测定10批河北产淡豆豉药材中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。结果:1指纹图谱的建立:(1)提取:以70%乙醇超声提取2h,然后以AB-8大孔吸附树脂进行吸附,70%乙醇进行洗脱为佳,具有稳定和效率高等优点。(2)色谱条件:色谱柱为Agilent HC-C18柱(250×4.6mm,5μm);乙腈-3%冰乙酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0ml/min,柱温为25℃,检测波长为261nm,进样量10μl。(3)系统适用性试验:在此色谱条件下,染料木苷的保留时间约为21min,按染料木苷峰计算理论板数约为10万,与其它色谱峰的分离度大于1.0。(4)稳定性试验:以染料木苷峰为内参比峰,计算各主要色谱峰相对保留时间及峰面积占总峰面积5%以上峰的相对峰面积值,其RSD分别为0.02%~1.06%和0.07%~1.30%,稳定性良好。(5)精密度试验:各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上峰的峰面积比值均无明显变化,其RSD分别为0.01%~0.58%和0.1%~2.21%,精密度良好。(6)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上峰的峰面积比值均无明显变化,其RSD分别为0.02%~0.53%和0.10%~2.02%,重复性良好。(7)指纹图谱的建立:分别得到10批淫羊藿炮制淡豆豉、淡豆豉、黑豆原料的指纹图谱,并生成各药材对照指纹图谱。(8)数据分析:运用相似度对所得数据进行分析,结果相似度均在0.99~1.00之间。(9)炮制辅料图谱的建立:分别得到淫羊藿、青蒿、桑叶药材在已选定色谱条件下的图谱。2总异黄酮成分的含量测定:(1)测定波长的确定:对照品溶液和供试品溶液均在263nm处有最大吸收,故确定263nm为测定波长。(2)标准曲线的制备:以染料木素吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制吸收曲线,经回归处理得染料木素的标准曲线方程:Y=0.1393X+0.0466,相关系数为r=0.999(n=5),通过回归方程可以看出,染料木素对照品浓度在1.590~5.566μg.ml-1范围内,与吸收度呈良好的线性关系。(3)稳定性试验:样品在48h内稳定,总异黄酮含量的RSD为1.00%。(4)精密度试验:样品精密度良好,总异黄酮含量的RSD为0.10%。(5)重复性试验:样品重复性良好,总异黄酮含量的RSD为0.73%。(6)回收率试验:染料木素的平均回收率为100.70%,RSD为1.36%(n=9)。(7)含量测定结果:淫羊藿炮制淡豆豉药材中总异黄酮的含量从2.6241~2.9907mg/g,平均含量为2.8187mg/g;淡豆豉药材中总异黄酮的含量从2.1323~2.7705mg/g,平均含量为2.4405 mg/g;黑豆原料中总异黄酮的含量从2.1119~2.8398mg/g;平均含量为2.2357mg/g。3四种大豆异黄酮成分的含量测定:(1)标准曲线的绘制:大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素分别在10.38~103.80μg、2.32~23.20μg、6.40~64.00μg、2.98~29.82μg范围内,呈良好的线性关系,回归方程分别为Y=26.059X+10.46,Y=35.181X-10.905,Y=89.756X-7.2494,Y=90.618X+57.825,相关系数均为r=0.9999(n=6)。(2)稳定性试验:样品在48h内稳定,大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的RSD分别为1.00%、0.43%、0.46%和0.42%。(3)精密度试验:样品的精密度良好,大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的RSD分别为1.59%、0.54%、1.24%和0.28%。(4)重复性试验:样品的重复性好,大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的RSD分别为2.36%、0.69%、1.51%和0.45%。(5)回收率试验:大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的回收率分别为99.27%、98.32%、98.76%和99.03%,RSD分别为0.72%、1.32%、1.11%和0.80%。(6)大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的最低检测限分别为0.522ng、0.122ng、0.318ng和0.152ng。(7)含量测定结果:河北产淡豆豉药材中大豆苷的含量从426.2~453.2μg/g,染料木苷的含量从376.1~401.3μg/g,大豆苷元的含量从247.6~263.8μg/g ,染料木素的含量从135.4~149.6μg/g不等。结论:1建立了不同辅料炮制的淡豆豉中大豆异黄酮HPLC指纹图谱及UV含量测定方法,比较了不同辅料对淡豆豉炮制过程的影响,揭示了淡豆豉的炮制机理:炮制过程是多种成分综合作用的过程,总体上来讲是苷向苷元转化的过程。2首次建立了淡豆豉样品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素多指标成分含量测定的HPLC法,方法稳定,重复性和精密度良好,为科学评价与有效控制河北产淡豆豉药材的质量提供了科学依据。