杜仲钙调蛋白基因EuCALML5的克隆及表达分析

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杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国特有的第三纪孑遗植物,兼具极高的药用价值和经济价值,其主要药用部位是树皮,常用环剥的方式采收。剥皮后,杜仲极易因木质部大范围暴露在空气中而导致水分蒸发,易造成水/盐胁迫。在杜仲新皮再生过程中,常用激素处理以促进愈伤组织形成和维管束形成层再生。Ca2+-钙感受器信号通路与激素信号途径密切相关,已有研究表明钙感受器可以通过激素途径发挥作用,同时钙信号也是水/盐胁迫的重要信号通路,因此,钙调蛋白(Ca M)/类钙调蛋白(CML)基因可能参与杜仲体内信号激素调节和对干旱胁迫、盐胁迫的响应,提高杜仲对逆境的适应能力。目前对CML基因的研究较少,且主要集中在拟南芥Ca M/CML家族,CML在生理和分子水平上的作用在很大程度上还是未知的。本研究在课题组前期构建的杜仲基因组和转录组数据库的基础上,从杜仲成熟叶片c DNA中,克隆出杜仲Eu CALML5-like(Calmodulin-like protein 5-like)基因的全长序列,对其进行生物信息学发现:该基因碱基数为282bp,共编码93个氨基酸,氨基酸序列含有EF-hand结构域基序,空间结构具有螺旋-环-螺旋样结构,符合钙调蛋白/类钙调蛋白结构特征,进化关系上与木本植物类钙调蛋白较近,基本认定Eu CALML5-like基因为杜仲钙调蛋白/类钙调蛋白家族成员。对其进行实时荧光定量分析,结果发现:Eu CALML5-like基因在杜仲幼龄无菌苗的根中表达最高,在其茎和叶中表达量较低,且表达量相近;Eu CALML5-like基因受干旱胁迫、盐胁迫、生长素处理和茉莉酸甲酯处理诱导,出现不同程度的上调。此外,本实验以杜仲下胚轴为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,成功获得若干转基因杜仲植株。本实验为阐明杜仲类钙调蛋白基因的调控机理奠定一定的理论基础,也为合理高效利用杜仲资源提供了科学依据。
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