泛素-蛋白酶体系统是真核生物体内普遍存在的蛋白质降解系统,在许多生物学进程中都发挥着重要作用,其异常与炎症、癌症及神经退行性疾病等密切相关。泛素化修饰通过由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)及泛素连接酶(E3)参与介导的酶促级联反应完成,最后经蛋白酶体降解。其中E3决定底物识别的特异性,是蛋白质泛素化领域的研究热点。E3可以分为两大类:含有RING(really interesting new gene)锌指结构和HECT(homologous to E6AP C-terminus)结构域的E3。RING类E3中的大多数是基于Cullin蛋白的多亚基复合体,其中基于Cullin1所形成的SCF(Skp1-Cullin1-F-box)复合体是研究最多、最深入的RING类E3复合体。它以支架蛋白Cullin1为中心, C端结合RING锌指蛋白Roc1,N端结合接头蛋白Skp1,Skp1又进一步募集不同的F-box蛋白,F-box蛋白担当底物识别亚基的角色,这样SCF复合体就利用不同的F-box蛋白形成不同复合体,从而结合不同的底物,在细胞周期调控、细胞生长及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥着重要作用。相对于RING类E3,HECT类E3的功能与机制研究相对较少,认识大多来自对于Nedd4 ( neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)家族的研究。Nedd4家族具有典型的C2-WW-HECT结构域组成,包含9个成员。目前已知的HECT类E3调控机制包括E3与底物的结合、E2与E3的结合亲和力及E3的分子内自抑制等。Smurf1(Smad ubiquitination regulatory factor 1)是Nedd4家族的典型代表,是发现的第一个能够降解Smads的E3,其发现首次将TGF-β/BMP通路与泛素-蛋白酶体通路联系起来。Smurf1可以通过降解经典BMP通路的受体型Smad(s如Smad1、Smad5)和BMP受体等负调控BMP通路。Smurf1-/-小鼠表现出年龄依赖的骨量上升,这表明Smurf1具有负调控骨形成等重要的生理功能。我们实验室之前揭示了CKIP-1(casein kinase-2 interacting protein 1)可通过特异结合Smurf1 WW结构域之间的连接区来增强Smurf1自身E3活性,从而揭示了一种“linker-regulator”式的调控机制,为HECT类E3贡献了一种新的调控模式。在此基础上,为进一步揭示Nedd4家族的功能及新的调控机制,我们以Nedd4家族9个成员的WW区域(WW结构域+连接区)、HECT结构域为诱饵对成人肝、脑文库进行了酵母双杂交筛选,并获得了近180对相互作用对。在对具有潜在研究意义的对象进行文献调研后,Smurf1筛选得到的猎物蛋白FBXL15(F-box and LRR-containing protein 15)引起了我们的强烈关注,因为FBXL15为典型的F-box蛋白,即上述提到的RING类SCF复合体的底物识别亚基,如果FBXL15与Smurf1存在关联,那将是首次建立SCF复合体与HECT类E3之间的联系。F-box蛋白是一个大的蛋白家族,人中共有69个成员。根据C端所含结构域的不同,F-box蛋白可以分为三类:含有WD40结构域的FBXW亚家族,含有LRR区的FBXL亚家族,以及含有其它结构域的FBXO亚家族。FBXL15属于其中的FBXL亚类,由300个氨基酸组成,包括N端的F-box模序和C端的6个亮氨酸富含区。我们首先利用免疫共沉淀、亚细胞定位等实验证实FBXL15与Smurf1在体内确实存在相互作用,并通过精细相互作用实验,揭示了FBXL15通过其C端的LRR区与Smurf1 HECT结构域N-lobe的large subdomain发生相互作用。HECT结构域由N-lobe和C-lobe组成,N-lobe又包含large和small两个subdomain,其中C-lobe含有催化活性中心,N-lobe small subdomain含有E2结合位点,FBXL15与Smurf1的作用位点与上述区域均不重叠,首次揭示了large subdomain的功能。在调控机制方面,我们发现FBXL15作为一种F-box蛋白可通过其N端F-box模序形成经典的SCF复合体,FBXL15靶向调控Smurf1蛋白稳定性,并介导其泛素化和蛋白酶体降解,并且这种调控不依赖Smurf1的自身E3活性,而是依赖SCFFBXL15复合体完整性对Smurf1稳定性的反式调控。这是区别于E3自身泛素化机制(或称作顺式调控)的一种新的HECT类E3稳定性调控模式。我们还确定了FBXL15泛素化Smurf1的主要位点为位于WW-HECT连接区的K355、K357,突变这两个位点将拮抗FBXL15对Smurf1的降解和泛素化及随后的生物学效应,这也是首次精确鉴定Smurf1的泛素化位点。另外我们又考察了FBXL15与整个Nedd4家族的关系。通过以上实验我们就建立起SCF复合体与HECT类E3之间的功能关联。在生理功能研究上,基于Smurf1是BMP通路的主要负调控分子,而FBXL15又负调控Smurf1稳定性,我们推测FBXL15应是BMP通路的正向调控因子。BMP通路在胚胎早期发育、成体骨调控过程中均发挥着重要作用,为此我们首先从外源Smurf1底物、磷酸化Smad水平、BMP通路活性、BMP通路靶基因等方面证实FBXL15确实可拮抗Smurf1对BMP通路的抑制效应。然后利用发育生物学研究的模式生物斑马鱼证实,在敲低FBXL15后,Smurf1蛋白水平升高,胚胎呈现明显的背部化表型,与bmp2b缺陷型突变体的表型一致,揭示FBXL15参与胚胎发育过程中背腹轴的分化,这是首次揭示F-box蛋白在胚胎背腹轴分化过程中的作用。在骨调控方面,我们利用特异靶向骨组织的siRNA递送系统,以大鼠为模型,将FBXL15 siRNA递送到大鼠骨组织中,发现大鼠骨密度、相对骨量、骨小梁数量和厚度等骨指标均显著下降,大鼠呈现明显的骨质疏松表型。这表明FBXL15在成体骨稳态维持过程中发挥着重要作用,可能是参与骨平衡的又一重要分子。这样我们就从分子、细胞、动物整体水平证实了FBXL15-Smurf1的调控意义,第一次揭示了SCF复合体在胚胎背腹轴分化、成体骨平衡维持中的重要作用,拓展了SCF复合体的功能范围。综上所述,我们的研究揭示了F-box蛋白FBXL15可形成SCF复合体并反式调控HECT类E3 Smurf1的蛋白稳定性,阐明了该调控关系在BMP通路、胚胎发育及成体骨稳态调控中的作用。这是首次揭示HECT类E3可被SCF复合体反式调控,提供了HECT类E3稳定性调控的新机制,并第一次揭示FBXL15的底物和生理功能。