肝纤维化（Hepatic Fibrosis）是指肝脏在各种慢性炎症或损伤的持续刺激下发生的肝脏内纤维结缔组织异常增生。目前认为肝纤维化的形成机制是各种致病因子造成肝细胞损伤,引起肝枯否细胞（Kupffer Cells,KCs）、血小板、肝窦状内皮细胞和肝细胞等激活,分泌多种细胞因子（Cytokine）与化学递质共同作用于肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells,HSCs）,使其激活和增殖并最终分化成肌成纤维细胞。巨噬细胞在慢性肝脏损伤病理中发挥着核心作用,研究表明不同巨噬细胞亚型已经被证实在肝纤维化的进展中发挥着关键性的调节因素,在肝脏损伤的进展和恢复过程中发挥着不同的功能,巨噬细胞或者KCs分泌的细胞因子是肝纤维化进展的重要调节因子。另外,小鼠外周单核巨噬细胞迁移浸润是肝脏炎症和纤维化进展的关键因素。电压依赖性钾离子通道亚型1.3（Kv1.3）作为电压依赖性钾离子通道家族的成员,参与纤维化等多种疾病的发生和发展,且与调节免疫细胞功能的关系密切。Kv1.3表达于多种组织和细胞中,尤其在免疫细胞中高表达。它最初是在T淋巴细胞中发现的,是调节T细胞活性和分化的重要因素。目前Kv1.3调节巨噬细胞功能的研究还未完全明确,Kv1.3阻断剂通过调节巨噬细胞功能应用于肝纤维化的治疗方案还未见报道。本课题应用Kv1.3选择性阻断剂玛格毒素（Margatoxin,Mg TX）于肝纤维化模型,观察其对巨噬细胞表型变化、细胞因子的分泌功能影响。应用玛格毒素作用于巨噬细胞株,通过转录组高通量测序寻找其与巨噬细胞迁移功能相关的靶点,观察其对外周单核细胞向肝脏迁移的影响。通过玛格毒素对巨噬细胞表型变化、细胞因子分泌及迁移功能的调节作用,探讨玛格毒素减轻肝纤维化的作用机制。为此,我们课题进行如下研究。灌流腹腔正常大鼠巨噬细胞,使用全细胞膜片器技术记录正常大鼠腹腔巨噬细胞的电生理特征和动力学参数。通过使用钾离子通道非选择性阻断剂四乙胺（TEA）、选择性抑制剂（Mg TX）以及替换细胞内液钾离子为铯离子的方法记录巨噬细胞电流,检测该电压依赖性钾离子通道的类型和通道亚型。结果显示,正常大鼠腹腔巨噬细胞电流表现为外向型整流的特征,电流强度随着细胞的去极化而增大,且该电流能基本被TEA和Mg TX阻断,当电极内液中用铯离子替代钾离子,外向型电流基本消失。提示腹腔巨噬细胞上主要表达的是电压依赖性钾离子通道,且这种电压依赖性钾离子通道以Kv1.3亚型的形式存在于腹腔巨噬细胞上。利用Kv1.3通道选择性抑制剂Mg TX,观察其对肝纤维化小鼠的影响并探讨作用机制。建立小鼠肝纤维化模型,给药组腹腔注射玛格毒素,通过苏木精-伊红（HE）、Masson、天狼猩红、免疫组织化学染色观察四氯化碳引起的严重的脂肪变性、免疫细胞浸润、纤维化程度。采用免疫组化和蛋白印迹（WB）的方法观察肝脏组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、金属蛋白酶12（MMP12）、基质金属蛋白酶13（MMP13）、骨膜蛋白（Periostin,POSTN）、δ-连环蛋白（δ-catenin）、趋化因子2（CCL2）和电压依赖性钾离子通道亚型1.3（Kv1.3）的表达变化。为了进一步了解玛格毒素降低肝纤维化相关蛋白的表达水平与巨噬细胞/枯否细胞相关,本课题以RAW264.7细胞株为研究对象,并诱导RAW264.7细胞株表型M1、M2亚型,采用蛋白印迹方法检测玛格毒素对肝纤维化相关蛋白（MMP12、MMP13、POSTN、CCL2、Kv1.3和δ-catenin）的在M1、M2中的表达变化。为了研究Kv1.3在调节四氯化碳引起的肝纤维化小鼠血清中细胞因子水平的变化,我们采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定肝纤维化小鼠注射玛格毒素组血清中重要的细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-20、TNF-α、IL-10、TGF-β）的含量变化。为了研究玛格毒素是否通过影响巨噬细胞的表型减轻肝纤维化的进展,将RAW264.7细胞株诱导为M1、M2两种亚型,采用实时定量PCR和蛋白印迹技术检测M1、M2两种亚型在使用玛格毒素后其表面标志物的表达变化。既往研究发现,巨噬细胞M1、M2亚型表型与STAT1/STAT6信号通路有关。为了验证玛格毒素是否通过STAT1/STAT6信号通路影响巨噬细胞表型,采用蛋白印迹方法检测使用玛格毒素M1、M2亚型组中磷酸化STAT1/STAT6的水平变化。实验结果表明,玛格毒素能减轻四氯化碳引起的肝纤维化的病理特征,降低肝纤维化组织中α-SMA和CollagenⅠ的表达,显著降低肝纤维化相关蛋白（MMP12、MMP13、POSTN、CCL2、Kv1.3和δ-catenin）的表达水平和调节肝纤维化相关的细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-20、TNF-α、IL-10、TGF-β）血清中的含量,且玛格毒素通过调节STAT1磷酸化水平降低巨噬细胞M1表型标志物（i NOS、CCL2、TNF-α和IL-1β）的表达,通过调节STAT6磷酸化水平升高巨噬细胞M2表型标志物（IL-10、CD163、Arg-1和MRC-2）的表达,从而减轻肝纤维化进展。因此提示玛格毒素可能通过调节巨噬细胞表型的转换和炎性因子的分泌发挥抗纤维化作用。肝纤维化早期,外周巨噬细胞向肝脏迁移、浸润是促进肝纤维化的重要因素,为此,我们进一步探讨了Mg TX影响肝纤维化的机制可能是降低外周巨噬细胞向肝脏的迁移。为了寻找玛格毒素对巨噬细胞迁移功能作用的靶点,采用转录组高通量测序筛选的方法检测玛格毒素对RAW264.7细胞株相关靶点RNA水平表达变化的影响,并寻找出差异变化最大的基因（δ-catenin）和相关信号通路（Rho GTPase）,采用实时定量PCR和WB的方法验证玛格毒素调节δ-catenin的表达与转录组高通量筛选结果一致性,且观察其对δ-catenin的表达变化是否具有剂量依耐性,并进一步研究其功能。通过敲低RAW264.7细胞株中δ-catenin或者过表达δ-catenin基因,应用细胞划痕和Transwell实验来验证玛格毒素是否通过降低δ-catenin基因的表达影响巨噬细胞迁移。在转录组高通量测序的结果中,δ-catenin的下游信号通路为Rho GTPases,且Rho GTPases信号通路与细胞的迁移功能相关。为此,采用实时定量PCR方法检测δ-catenin过表达、沉默及使用玛格毒素对Rho GTPases家族Rho A、Rac、Cdc42的表达变化影响,并确定δ-catenin和玛格毒素对Rho A亚家族表达影响,进一步采用实时定量PCR和蛋白印迹的方法验证δ-catenin过表达、沉默或者使用玛格毒素对Rho A表达的影响及相关性。实验结果显示,玛格毒素靶向下调δ-catenin的表达水平,且玛格毒素降低δ-catenin表达的作用具有剂量依赖性。使用玛格毒素或敲低δ-catenin均能明显降低巨噬细胞的迁移能力,过表达δ-catenin能提高巨噬细胞的迁移功能,且δ-catenin和Rho A的表达变化正相关。因此玛格毒素通过降低δ-catenin表达并通过下游的Rho A信号通路减少外周单核巨噬细胞向肝脏迁移数量,这可能是玛格毒素减缓肝纤维化进展的重要机制。本课题通过电生理膜片钳技术检测腹腔巨噬细胞上主要存在电压依赖性钾离子通道亚型（Kv1.3）,且Kv1.3在小鼠肝纤维化组织中高表达。通过腹腔注射Kv1.3通道阻断剂Mg TX于肝纤维化小鼠,能显著降低Kv1.3的表达和减轻小鼠肝纤维化病理特征,提示Kv1.3与肝纤维化进展的关系密切,抑制Kv1.3能发挥对肝纤维化小鼠的保护作用。Kv1.3通道阻断剂Mg TX保护肝脏作用机制可能是:1、玛格毒素通过STAT信号通路影响巨噬细胞表型变化和细胞因子分泌功能;2、玛格毒素通过靶向降低δ-catenin表达并通过Rho A信号通路影响巨噬细胞的迁移功能。