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研究背景蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是由脑底部或脑表面的病变血管破裂，血液直接流入蛛网膜下腔引起的一种临床综合征。流行病学调查显示，SAH约占急性脑卒中的10%左右,大多数蛛网膜下腔出血是由动脉瘤破裂导致的。动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一种极其危重的疾病，其致残率和致死率都很高。蛛网膜下腔出血主要的患病人群是40-60岁的中老年人。每年的发病率大约是10/100,000，其中有12%的SAH患病人群在进入医院接受治疗之前死亡，另外有40%的SAH患者在入院治疗1个月内死亡。在所有幸存下来的SAH患者中约30%会遗留严重的神经功能障碍，导致生活不能自理。50%的患者在较长一段时间内伴有认知功能障碍，而且这种认知障碍几乎不可能恢复到病前水平。虽然SAH的诊断技术和外科治疗措施有了很大提高和改进，但是SAH患者的临床预后仍然不理想。目前为止，研究发现导致SAH患者高致残率和高致死率的主要因素是脑血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)和早期脑损伤(earlybrain injury,EBI).。CVS在SAH后的第1天出现，在SAH后6-8天达到高峰，并持续2-3周。CVS是SAH最常见的高危并发症，常可继发严重的脑组织缺血，进而出现迟发性脑缺血，导致患者遗留严重的神经功能障碍，甚至是死亡。以往一直认为CVS是导致SAH患者死亡率高和预后不良的主要原因，所以数十年来，研究者们将重点放在了CVS上，但是针对这些机制的治疗措施并没有明显改善SAH患者的预后。近年来的研究发现，SAH后EBI也与患者的长期不良预后有关，EBI是SAH后的前72小时内出现的脑组织的损伤，有学者提出一个挑战性的观点：EBI对SAH预后的影响比CVS大。EBI的病理生理机制包括由颅内压的急剧增加和脑灌注压的急剧下降导致的弥漫性的脑缺血损伤，细胞凋亡的激活，血脑屏障的破坏，脑水肿和免疫炎症反应等。在深入理解SAH后CVS及EBI的发病机制的基础上，寻找出安全、有效、易于实施的防治措施是改善SAH患者预后的关键环节。虽然长期以来国内外对SAH后CVS及EBI的研究投入了大量人力和物力，然而迄今为止仍然缺乏切实有效的防治手段。近几年的研究发现由活化的免疫系统介导的免疫炎症反应在许多中枢神经系统疾病中发挥着重要的作用。国内外学者的大量研究显示SAH后痉挛的脑动脉壁和脑实质中存在显著而持续的免疫炎症反应。在脑动脉瘤破裂发生SAH后，血液进入蛛网膜下腔并裂解释放出血红蛋白、胆红素等物质从而激活免疫炎症系统。SAH后脑动脉壁中有中性粒细胞、巨噬细胞和其它免疫细胞浸润，免疫球蛋白及补体沉积，以及血管内皮发生肿胀与变性凋亡、血管中膜及外膜增厚等炎症表现，上述变化与CVS发生的时相及迟发性缺血性神经功能损害相一致。而且，在SAH大鼠脑组织中，许多与免疫炎症相关的基因及其产物发生了明显的变化。虽然具有许多潜在的副作用，旨在以减轻免疫炎症反应为目标的干预药物如类固醇激素、免疫抑制剂等对SAH后CVS及EBI显示出了肯定的效果。因此，免疫炎症反应是蛛网膜下腔出血后CVS及EBI有前景的治疗靶点。抑制过度免疫反应和炎性细胞激活、浸润及炎性细胞因子等的产生有望成为防治SAH后CVS及EBI的新的有效途径。研究目的1.探讨调节性T细胞过继转输对SAH后脑血管痉挛的缓解作用。2.探讨调节性T细胞过继转输在SAH后早期脑损伤中的保护作用。3.观察调节性T细胞过继转输对SAH后细胞损伤、凋亡及其相关因子的影响，以确定调节性T细胞对SAH后脑损伤保护的有关分子机制。从利用具有免疫抑制作用的调节性T细胞对SAH大鼠模型进行干预的方法中寻找可以治疗或改善SAH患者预后的药物。研究方法1.选择健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，体重在300-350g之间，随机将大鼠分成假手术组、SAH+PBS处理组、SAH+脾细胞（spleen cells，SP）处理组、SAH+调节性T细胞(Tregs)治疗组。选择经股静脉输注的方法对SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Treg治疗组这三个组的动物模型进行治疗干预。2.对上述分组的实验动物，在模型制作前及枕大池二次注血后6小时和12小时时用激光多普勒血流计动态测量动物顶叶皮层局部脑血流量（regional cerebral bloodflow,rCBF）；于SAH后2天时，经心脏灌注固定后分离出大鼠脑干做成冰冻切片，通过H-E染色法染色，在显微镜下观察基底动脉形态学变化，测定并比较各组大鼠模型基底动脉内外径和管壁厚度的变化。3.对上述分组动物，在SAH后2天时，留取大鼠新鲜的大脑皮层脑组织并提取蛋白，用Western blot法检测大脑皮层中基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)的表达水平；于SAH后2天时，用干湿重法测定并比较各组大鼠脑组织的含水率。4.在SAH后2天时，对脑组织切片行尼氏染色，用显微测量尺测量海马CA1区神经元细胞密度；用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP末端缺口标记法(Terminal deoxynuleotidyl transferase-mediated Dutp-biotin nick end-labaling，TUNEL)检测各组大鼠大脑皮层中的原位神经细胞的凋亡，对凋亡细胞计数并比较各组大鼠大脑皮层凋亡细胞数目的差异；用免疫荧光法检测并比较各组大鼠大脑皮层中activecaspase-3阳性表达的细胞数的差异；通过western blot法检测大脑皮层中activecaspase-3的表达水平。研究结果1.（1）除假手术组之外， SAH+PBS组、SAH+SP组、SAH+Tregs组大鼠模型制作之后6h和12h时顶叶皮层的rCBF均较模型制作之前的rCBF显著减少(p<0.01)，其中以SAH后PBS治疗组和SP治疗组最为明显，SAH后静脉输注Tregs治疗组的rCBF较另外两个治疗组显著改善(p<0.05)。（2）SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组比假手术组的基底动脉明显痉挛缩窄、管壁增厚(p<0.05)，SAH+Tregs治疗组模型又比前两个治疗组的基底动脉管径显著增大，管壁变薄(p<0.01)。2.（1）干湿重法测定结果发现SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组脑组织含水率较假手术组大鼠脑组织的含水率显著增加(p<0.05),Tregs细胞治疗组又比PBS处理组和SP处理组大鼠脑组织的含水率明显减少(p<0.05)；（2）Westernblot测定结果发现，与假手术组相比，SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组MMP-9的表达量均显著增加(p<0.05)，而SAH+Tregs治疗组中该蛋白酶的表达量较SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组明显减少(p<0.05)。3.（1）在SAH后2天，尼氏染色发现SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组大鼠海马CA1区正常椎体细胞密度较假手术组显著减小(p<0.05)，SAH+Tregs治疗组大鼠海马CA1区的正常椎体细胞密度较SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组明显增大(p<0.05)；（2）TUNEL染色法发现SAH后，SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组大鼠大脑皮层中的凋亡细胞数较假手术组显著增多(p<0.05),SAH+Tregs治疗组中凋亡细胞数目明显减少(p<0.05)；（3）通过免疫荧光法发现SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组大鼠大脑皮层中表达active caspase-3的细胞数较假手术组大鼠模型大脑皮层中active caspase-3的阳性细胞数显著增加（p<0.05），SAH+Tregs治疗组大鼠大脑皮层中active caspase-3阳性细胞数较SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组明显减少（p<0.05）。（4）western blot法发现SAH+PBS处理组、SAH+SP处理组、SAH+Tregs治疗组大鼠大脑皮层中activecaspase-3的表达水平较假手术组大鼠大脑皮层中active caspase-3的表达水平显著增加（p<0.01），SAH+Tregs治疗组大鼠模型大脑皮层中active caspase-3的表达水平较SAH+PBS处理组和SAH+SP处理组大鼠大脑皮层中active caspase-3的表达水平明显减少（p<0.05）。研究结论1.调节性T细胞过继转输可以缓解SAH后脑血管痉挛的程度和基底动脉的病理变化程度。2.调节性T细胞过继转输可以减轻SAH后脑水肿的程度，减少SAH后MMP-9的表达。3.调节性T细胞的过继转输通过调节active caspase-3的表达而抑制SAH后脑组织细胞发生细胞凋亡。