番石榴焦腐病病原鉴定、生物学物性及分子检测技术研究

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番石榴焦腐病为常见的采后病害。病原菌为害树干、叶柄及果实,因果实被害较多,故又名蒂腐病。病原菌为害果实时,多自果柄处开始,初呈水浸状、软化,不久全果腐烂。病原菌在PDA培养基上菌落初为白色,有许多气生菌丝,逐渐变成暗灰色,菌丝表面呈现许多棉絮状突起。未成熟的孢子单胞,近卵形,无色,成熟的孢子双胞,暗褐色,具纵条纹,其大小为20~29μm×10~14μm。依据孢子特征、产孢细胞特征、病原菌生物学特性,及其核糖体DNA转录间隔区(internal transcribed spacers,ITS)序列,将其鉴定为柑橘葡萄座腔菌(Botryosphaeria rhodina(Cke.)Arx)。   番石榴焦腐病菌的生长适温度为25~35℃,以32℃时菌丝生长最为良好。病原菌在pH值4~10的范围内菌丝均能良好生长,但以酸性较佳。蔗糖、葡萄糖有利于菌丝的生长,蔗糖有利于子座的产生,蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和甘露醇均可促进分生孢子的萌发。光照会抑制菌丝生长,而要产孢则需要在有光照的条件。分生孢子的萌发要求高湿度,其萌发率随着相对湿度的增加而提高,在水中的萌发率可达88.7%,而在相对湿度低于85%时孢子不能萌发。菌丝体的致死温度为52℃(10分钟)。室内药效测定结果表明:咪酰胺抑菌效果最好,EC50为0.20786μg/mL,苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、代森锰锌、咪康唑和嘧菌酯效果次之,EC50分别为2.56606、3.76205、4.57956、8.06035、10.85537μg/mL。   番石榴焦腐病是台湾入境大陆水果的重要植物病害。为建立该病原菌快速、灵敏的检测技术,比较分析了柑橘葡萄座腔菌和葡萄座腔菌属其它种的ITS序列,在此基础上设计了1对检测番石榴焦腐病菌的特异引物BF1/BR1,利用此引物从柑橘葡萄座腔菌中扩增出287 bp特异条带,而其余参试的菌株未能获得扩增条带。将真菌通用引物ITS1/ITS4和BF1/BR1进行巢式PCR扩增后,检测灵敏度提高1,000倍,可检测到1 pg葡萄座腔菌基因组DNA。结合快速碱裂解法提取发病组织的DNA,采用该PCR检测技术可从自然感染焦腐病果实中检测到葡萄座腔菌。   采用改良平板对峙法测定了10株细菌对番石榴焦腐病菌株的拮抗作用,并进一步分析明确了拮抗菌株ZB—6的抑菌活性,发现拮抗菌株ZB—6培养滤液对番石榴焦腐病菌分生孢子的萌发具有明显的抑制作用,致分生孢子变畸形产生大泡囊;经pH5.6~8.6和温度40~80℃处理,对番石榴焦腐病菌具有较好的抑制活性,对番石榴焦腐病菌具有较好的抑制作用,离体测定防治效果达到46.15%。
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