论文部分内容阅读
目的：用扶正祛毒复方含药血清干预急性T淋巴细胞白血病完全缓解期患者CD34+细胞DCs的诱导，观察诱导后DCs形态及相关抗原分子的表达，以及DCs诱导成熟前后血清中肿瘤坏死因子α、可溶性肿瘤坏死因子α受体的变化，并分析其与DCs的关系，探究扶正祛毒复方对T-ALL-CR患者免疫功能的影响。
方法：1.分别用扶正祛毒复方低、中、高剂量煎剂早晚定时给健康新西兰大白兔灌胃三天，于末次灌胃2h后在无菌条件下采集心脏血，分别制备低、中、高浓度的中药含药兔血清及空白兔血清备用。2.抽取符合纳入实验标准的患者骨髓，采用Ficoll密度梯度离心得到BMNC，再用免疫磁珠阳性选择法得到纯化的CD34+细胞并进行扩增，在CD34+细胞扩增期间加入IL-3、TPO、Fit-3、SCF共同培养，使CD34+细胞呈对数生长后开始DCs诱导。3.将CD34+细胞和低、中、高剂量复方含药兔血清联合IFN-α、GM-CSF、IL-4、TNF-α置于无菌六孔板中共同培养，保证每孔细胞数不少于1×106个/ml，共分为五组，即低剂量扶正祛毒复方+细胞因子组(FQD+YZ)、中剂量扶正祛毒复方+细胞因子组(FQZ+YZ)、高剂量扶正祛毒复方+细胞因子组(FQG+YZ)、细胞因子组(YZ)、空白兔血清组(KB)，在诱导过程中使用倒置显微镜观察并拍照记录DCs的形态变化情况。4.诱导9天后，收集细胞，运用流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测DCs表面抗原CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR的表达。5.于DCs培养的第0、6、9天分别留取各组细胞培养液上清约1ml，并测定其TNF-α、sTNF-αR的表达水平。
结果：1.DCs形态：显微镜下观察发现，随着扩增时间的延长，CD34+细胞数逐渐增多，布满视野，胞体逐渐增大，最终可见形态典型的DCs。第0天，细胞仍为星点状，3天后，可见细胞表面可见毛刺状小突起，并形成少量集落而半悬浮于培养液中;6天后，细胞数量及集落数增多，胞体较前增大，细胞膜向各方突起，形态各异，大小不等;9天后细胞数量及胞体明显增多增大，突起明显，呈典型树突状细胞形态。各中药含药血清组诱导的DCs形态均较YZ和KB典型。
2.DCs免疫表型：CD1a、CD86、CD80、CD83、HLA-DR各表面抗原在各组中均有表达，各中药含药兔血清组均优于YZ和KB，有统计学意义(P＜0.01)。其中CD83、CD80、CD86在FQG、FQZ、FQD中的表达均优于YZ和KB，有统计学意义(P＜0.01)，而YZ与KB比较无统计学意义，(P＞0.05)。CD1a在FQG、FQZ、FQD和YZ的表达均优于KB，有统计学意义(P＜0.05)，FQG、FQZ、FQD和YZ间比较无统计学意义(P＞0.05)，而YZ与KB比较有统计学意义，(P＜0.05)。HLA-DR在FQG、FQZ、FQD和YZ的表达均优于KB，有统计学意义(P＜0.01)，FQG、FQD、YZ间比较无统计学差异(P＞0.05)，而YZ与KB比较有统计学意义(P＜0.05)，FQZ的表达明显优于YZ，有统计学意义(P＜0.05)。
3.TNF-α、sTNF-αR水平检测
3.1.TNF-α的表达水平：各含药血清组的含量第9天均依次高于第6天、第0天，有统计学意义(P＜0.01)，YZ、KB在第0、6、9天之间比较无统计学意义(P＞0.05)。
DCs诱导的第0天，FQG明显高于FQZ、FQD、KB，有统计学意义(P＜0.05)，而FQG与YZ比较无统计学意义(P＞0.05);第6天，FQG明显高于FQZ、FQD、YZ、KB，有统计学意义(P＜0.01)，FQZ、FQD、YZ、KB间比较无统计学意义(P＞0.05);第9天，FQG明显高于FQZ、FQD、YZ、KB，有统计学意义(P＜0.01)，FQZ与FQD比较无统计学意义(P＞0.05)，YZ与KB比较无统计学意义(P＞0.05)。
3.2.sTNF-αR的表达水平：各含药血清联合细胞因子组第9天均明显低于第0天，有统计学意义(P＜0.05)。FQG第6天明显低于第0天，有统计学意义(P＜0.05)，而第6天与第9天比较无统计学意义(P＞0.05)。VQZ、FQD第9天与第6天比较无统计学意义(P＞0.05)，FQZ、FQD第6天与第0天比较无统计学意义(P＞0.05)。YZ、KB在第0、6、9天之间比较无统计学意义(P＞0.05)。第0天，各组间比较无统计学意义(P＞0.05)。第6天、第9天，VQG明显低于VQD、YZ、KB，有统计学意义(P＜0.05)，而FQG与VQZ比较无统计学意义(P＞0.05)，FQZ、FQD、YZ、KB间比较无统计学意义(P＞0.05)。
结论：1.不同浓度的扶正祛毒复方含药血清均可诱导T-ALL-CR患者CD34+细胞转化为典型的DCs，能较高表达DCs表面抗原CD83、CD86、CD80、CD1a、HLA-DR。无明显浓度依赖性。
2.扶正祛毒复方含药血清诱导T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs成熟的过程中，培养液上清中TNF-α的表达水平随着培养时间延长而逐渐升高，其中各含药血清组均高于空白组和细胞因子组，且高剂量组表达水平高于中剂量组和低剂量组。而sTNF-αR的表达水平在各含药血清组均随着培养时间延长而逐渐降低，在第9天时降低最明显，其中又以高剂量组降低最为显著。
方法：1.分别用扶正祛毒复方低、中、高剂量煎剂早晚定时给健康新西兰大白兔灌胃三天，于末次灌胃2h后在无菌条件下采集心脏血，分别制备低、中、高浓度的中药含药兔血清及空白兔血清备用。2.抽取符合纳入实验标准的患者骨髓，采用Ficoll密度梯度离心得到BMNC，再用免疫磁珠阳性选择法得到纯化的CD34+细胞并进行扩增，在CD34+细胞扩增期间加入IL-3、TPO、Fit-3、SCF共同培养，使CD34+细胞呈对数生长后开始DCs诱导。3.将CD34+细胞和低、中、高剂量复方含药兔血清联合IFN-α、GM-CSF、IL-4、TNF-α置于无菌六孔板中共同培养，保证每孔细胞数不少于1×106个/ml，共分为五组，即低剂量扶正祛毒复方+细胞因子组(FQD+YZ)、中剂量扶正祛毒复方+细胞因子组(FQZ+YZ)、高剂量扶正祛毒复方+细胞因子组(FQG+YZ)、细胞因子组(YZ)、空白兔血清组(KB)，在诱导过程中使用倒置显微镜观察并拍照记录DCs的形态变化情况。4.诱导9天后，收集细胞，运用流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)检测DCs表面抗原CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR的表达。5.于DCs培养的第0、6、9天分别留取各组细胞培养液上清约1ml，并测定其TNF-α、sTNF-αR的表达水平。
结果：1.DCs形态：显微镜下观察发现，随着扩增时间的延长，CD34+细胞数逐渐增多，布满视野，胞体逐渐增大，最终可见形态典型的DCs。第0天，细胞仍为星点状，3天后，可见细胞表面可见毛刺状小突起，并形成少量集落而半悬浮于培养液中;6天后，细胞数量及集落数增多，胞体较前增大，细胞膜向各方突起，形态各异，大小不等;9天后细胞数量及胞体明显增多增大，突起明显，呈典型树突状细胞形态。各中药含药血清组诱导的DCs形态均较YZ和KB典型。
2.DCs免疫表型：CD1a、CD86、CD80、CD83、HLA-DR各表面抗原在各组中均有表达，各中药含药兔血清组均优于YZ和KB，有统计学意义(P＜0.01)。其中CD83、CD80、CD86在FQG、FQZ、FQD中的表达均优于YZ和KB，有统计学意义(P＜0.01)，而YZ与KB比较无统计学意义，(P＞0.05)。CD1a在FQG、FQZ、FQD和YZ的表达均优于KB，有统计学意义(P＜0.05)，FQG、FQZ、FQD和YZ间比较无统计学意义(P＞0.05)，而YZ与KB比较有统计学意义，(P＜0.05)。HLA-DR在FQG、FQZ、FQD和YZ的表达均优于KB，有统计学意义(P＜0.01)，FQG、FQD、YZ间比较无统计学差异(P＞0.05)，而YZ与KB比较有统计学意义(P＜0.05)，FQZ的表达明显优于YZ，有统计学意义(P＜0.05)。
3.TNF-α、sTNF-αR水平检测
3.1.TNF-α的表达水平：各含药血清组的含量第9天均依次高于第6天、第0天，有统计学意义(P＜0.01)，YZ、KB在第0、6、9天之间比较无统计学意义(P＞0.05)。
DCs诱导的第0天，FQG明显高于FQZ、FQD、KB，有统计学意义(P＜0.05)，而FQG与YZ比较无统计学意义(P＞0.05);第6天，FQG明显高于FQZ、FQD、YZ、KB，有统计学意义(P＜0.01)，FQZ、FQD、YZ、KB间比较无统计学意义(P＞0.05);第9天，FQG明显高于FQZ、FQD、YZ、KB，有统计学意义(P＜0.01)，FQZ与FQD比较无统计学意义(P＞0.05)，YZ与KB比较无统计学意义(P＞0.05)。
3.2.sTNF-αR的表达水平：各含药血清联合细胞因子组第9天均明显低于第0天，有统计学意义(P＜0.05)。FQG第6天明显低于第0天，有统计学意义(P＜0.05)，而第6天与第9天比较无统计学意义(P＞0.05)。VQZ、FQD第9天与第6天比较无统计学意义(P＞0.05)，FQZ、FQD第6天与第0天比较无统计学意义(P＞0.05)。YZ、KB在第0、6、9天之间比较无统计学意义(P＞0.05)。第0天，各组间比较无统计学意义(P＞0.05)。第6天、第9天，VQG明显低于VQD、YZ、KB，有统计学意义(P＜0.05)，而FQG与VQZ比较无统计学意义(P＞0.05)，FQZ、FQD、YZ、KB间比较无统计学意义(P＞0.05)。
结论：1.不同浓度的扶正祛毒复方含药血清均可诱导T-ALL-CR患者CD34+细胞转化为典型的DCs，能较高表达DCs表面抗原CD83、CD86、CD80、CD1a、HLA-DR。无明显浓度依赖性。
2.扶正祛毒复方含药血清诱导T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs成熟的过程中，培养液上清中TNF-α的表达水平随着培养时间延长而逐渐升高，其中各含药血清组均高于空白组和细胞因子组，且高剂量组表达水平高于中剂量组和低剂量组。而sTNF-αR的表达水平在各含药血清组均随着培养时间延长而逐渐降低，在第9天时降低最明显，其中又以高剂量组降低最为显著。