【摘 要】
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丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是一种重要的植物致病菌,广泛存在于自然环境中,丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（P.syringae pv.tomato DC3000）（Pst DC3000）,可在番茄和拟南芥上引起细菌性斑点病。自被分离发现以来,Pst DC3000常作为一个重要的模式菌株,应用在分子植物病理学的研究中,由于它携带了大量的潜在毒性因素,也常应用到一些通
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丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）是一种重要的植物致病菌,广泛存在于自然环境中,丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000（P.syringae pv.tomato DC3000）（Pst DC3000）,可在番茄和拟南芥上引起细菌性斑点病。自被分离发现以来,Pst DC3000常作为一个重要的模式菌株,应用在分子植物病理学的研究中,由于它携带了大量的潜在毒性因素,也常应用到一些通过三型分泌系统分泌的效应蛋白的研究中。环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）作为细菌中的核酸类第二信使,广泛存在于细菌中,参与调节多种生理活动。c-di-GMP在调节菌体生物被膜状态和运动状态的转变中起着重要作用,细菌细胞外基质中胞外多糖的生物合成也受其调控。另外,c-di-GMP也能够调控细菌的致病性,主要是调节一些毒力因子的分泌和表达。对其在细胞内调控机制的研究,能够为细菌致病机制的研究提供帮助和指导。FleQ作为鞭毛的主效调节因子,最早在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中发现参与运动性的调控,还作为c-di-GMP的一个受体参与细菌生物膜的调控。FleQ同时也存在于Pst DC3000中,但其在该菌中的功能,以及与c-di-GMP的关系和对运动性和生物被膜等生物表型的调节机理尚不清楚。本文重点探究了丁香假单胞菌Pst DC3000中c-di-GMP与FleQ的调控机理,结果概括如下:本文首先构建了fleQ缺失突变体,发现调节因子FleQ的缺失可以导致细菌失去游动性,并且菌株生物被膜形成能力降低。利用氨基酸序列比对的方法,将丁香假单胞菌Pst DC3000中FleQ蛋白与铜绿假单胞菌PAO1中的FleQ进行氨基酸序列分析,发现两者的同源性高达83%。通过PAO1中的FleQ可以回补Pst DC3000中fleQ缺失引起的运动性丧失的实验,猜测Pst DC3000中的FleQ可能与铜绿假单胞菌PAO1中的FleQ具有功能同源性。前人的研究发现FleQ是一个依赖σ54的多结构域的转录调控因子,许多鞭毛基因和操纵子受FleQ调控。通过β-半乳糖苷酶活性实验发现鞭毛基因fliC在fleQ缺失突变体中表达量有明显下降,通过EMSA实验验证了FleQ能够在体外结合鞭毛基因fliC的启动子DNA,说明FleQ正调控鞭毛基因fliC的表达。通过ITC实验又发现FleQ可以直接体外结合c-di-GMP,并且c-diGMP可以解除FleQ和对fliC启动子的结合。丁香假单胞菌Pst DC3000中c-di-GMP对fliC的调控依赖于鞭毛调节因子FleQ。c-di-GMP可以通过FleQ调控鞭毛基因的表达影响运动性,在研究酶活性实验分析胞内c-di-GMP的合成和降解酶的过程中,分析了FleQ对c-di-GMP合成和降解过程的影响。发现FleQ不能合成c-di-GMP,但可以将GTP降解为GDP。利用等温滴定量热法（ITC）进一步分析FleQ蛋白与GTP的体外结合情况。结果显示,FleQ可以体外结合GTP。考虑到细菌内的生理活动往往是靠蛋白间相互作用调控的,构建了丁香假单胞菌Pst DC3000中FleQ的酵母双杂交库,发现了与FleQ互作的蛋白4654调控甲基化,以及FleQ的拮抗子Fle N。通过细菌双杂交还发现了与FleQ作用的c-di-GMP降解酶蛋白2757,但体外的结合验证有待进一步研究。通过酶活性实验发现FleQ不可以降解c-di-GMP,但可以阻止2757对c-di-GMP的降解。通过构建Fle N和2757的缺失菌株,发现两者的运动能力与野生型相比均下降。我们将在后面的研究中做进一步的探索。本文揭示了FleQ的生物学功能,确定了c-di-GMP与FleQ在Pst DC3000中对细菌运动性的影响,初步探索了Pst DC3000中与FleQ互作的蛋白调控c-di-GMP代谢过程,为完善c-di-GMP在丁香假单胞菌Pst DC3000的调控机制奠定了基础。
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