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日本血吸虫病(schistosomiasis)是制约我国养殖业经济发展、危害我国人民健康的重要的人畜共患病之一。吡喹酮是目前唯一一种大规模使用的治疗血吸虫病的药物,但已有喹酮耐药虫株出现的报道,使治疗血吸虫病新药物研发更加紧迫。本实验室前期研究发现日本血吸虫在不同适宜性宿主体内的生长发育情况与虫体体细胞凋亡现象具有一定的相关性,这为血吸虫病新药物靶标的筛选提供了新的思路。日本血吸虫凋亡诱导因子Sj AIF是位于线粒体内膜的一种蛋白,具有氧化还原酶和促凋亡功能。本课题组前期工作鉴定到了Sj AIF的碱基序列,为了阐述该基因的生物学特性和功能,本文展开了以下研究。1日本血吸虫凋亡诱导因子编码基因的克隆表达及生物学特性分析通过PCR扩增获得日本血吸虫凋亡诱导因子Sj AIF基因的功能区片段,大小为828 bp,编码276个氨基酸。生物信息学分析表明该蛋白不含信号肽,理论等电点为6.61。对目的基因的功能结构分析发现该基因片段包含一个4Lii(人线粒体凋亡诱导因子1)的功能区、一个吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族蛋白功能区及一个FAD/NAD(P)结合域超家族成员蛋白功能区。多重比对结果表明该基因所编码的氨基酸序列与埃及血吸虫的AIF相似性最高,达到68%。把扩增到的日本血吸虫凋亡诱导因子的功能区片段重组到原核表达载体p ET-28a,构建了重组表达质粒p ET-28a-Sj AIF,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导其表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量约为35 k D。实时定量PCR分析表明Sj AIF基因在童虫和成虫的各个发育阶段均有转录,其中7 d、14 d和21 d虫体表达量较低,42 d和28 d虫体表达量较高,雌虫表达量高于雄虫。同时,对Sj AIF在血吸虫非适宜宿主大鼠和适宜宿主小鼠来源虫体中的表达差异进行分析,结果表明,Sj AIF在大、小鼠来源的14 d,23 d,32 d,42 d四个时期虫体中均有表达,且在这四个时期中大鼠来源虫体的相对表达量均明显高于小鼠来源虫体。Western blotting结果表明重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。ELISA分析表明重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了较高水平的特异性Ig G抗体。应用免疫组化分析显示该蛋白主要存在于日本血吸虫体被,少部份分布于实质组织中。2 Sj AIF真核重组质粒在293T细胞中的表达分析通过PCR技术扩增到Sj AIF功能区片段,成功构建了真核重组表达质粒pc DNA3.1(+)-Sj AIF,利用脂质体转染法把重组质粒转入293T细胞。Western blotting分析结果表明重组质粒在293T细胞中成功表达,分子量大小约为31 k D,流式细胞术实验结果表明,重组质粒转染细胞实验组的细胞早期凋亡比例为35.35%,而对照组为6.7%,实验组的细胞晚期凋亡比例为4.53%,对照组为0.7%。实验组的早期凋亡和晚期凋亡比例均明显高于对照组。推测日本血吸虫凋亡诱导因子Sj AIF有一定的促凋亡作用。本文为深入开展Sj AIF的生物学功能分析,及筛选针对Sj AIF的药物靶标提供了基础。