论文部分内容阅读
冷泉是继热液之后另一种特殊的深海环境。南海冷泉生态系统以甲烷流体、自生碳酸盐岩、化能自养微生物群落以及大量的单质硫为特点。本研究利用2017年和2018年“科学号”冷泉-热液航次获得的冷泉沉积物样品,通过宏基因组学对南海冷泉微生物多样性和功能分布进行了分析。进而对冷泉沉积物样品中参与硫元素循环的微生物进行了筛选,获得了一系列硫氧化微生物和潜在的新属新种。在此基础上,对赤杆菌氧化硫代硫酸钠产单质硫的分子机制进行了深入研究;分析了化能自养硫氧化微生物的基因组信息;同时对一株潜在的新属新种进行了多相分类学研究。宏基因组学分析结果显示南海冷泉沉积物细菌主要类群为变形菌门、绿弯菌门和浮霉菌门;古菌主要类群为广古菌门和洛基古菌门。参与硫酸盐还原和甲烷厌氧氧化的微生物为冷泉沉积物环境中最主要的微生物类群。表层样品中异养微生物能量获得途径以三羧酸循环为主,深层样品中以糖酵解为主;表层样品中微生物固碳途径以还原性磷酸戊糖途径为主,而深层样品中以还原性三羧酸循环和WL（Wood-Ljungdahl）途径为主。参与硫氧化的功能基因主要分布在表层样品中,而参与硫酸盐还原的功能基因广泛分布在不同深度样品中。为了进一步了解冷泉沉积物中参与硫元素循环微生物的多样性,我们采用选择性培养基对冷泉沉积物中微生物进行了富集培养,以期能够获得典型的或者特殊的参与硫元素代谢的微生物。本研究一共获得26种纯培养微生物,分布于变形菌门、厚壁菌门和放线菌门。其中包括典型的化能自养硫氧化细菌（Guyparkeria hydrothermalis SP-2）、化能异养硫氧化细菌（Citreicella thiooxidans）,能够代谢硫代硫酸钠产生单质硫的赤杆菌（Erythrobacter flavus 21-3）以及三株潜在新属和新种。针对其中一株潜在新属NS-1进行了多相分类学研究。16S r RNA基因序列分析结果显示菌株NS-1属盐厌氧单胞菌科,与Halocella cellulosilytica相似性最高为92.52%。菌株NS-1是一株严格厌氧、发酵产氢、可降解纤维素的细菌。其最适生长温度为37 oC,最适生长p H值为7,最适生长Na Cl范围为25-75 g/L。可利用多种糖类进行发酵,发酵葡萄糖产物为乙酸、乙醇、乳酸、丁酸、二氧化碳和氢气。经过形态学观察、生理生化性质检测及遗传学分析等比较,菌株NS-1被认为是盐厌氧单胞菌科的新属新种。根据菌株NS-1的分离单位和样品来源,我们将其命名为Iocasia coldseepira,模式菌株为NS-1（=KCTC15988T=MCCC1K04439T）。这些微生物菌株的获得是本论文后续研究工作的前提和基础。同时,微生物的分离培养丰富了冷泉微生物菌种资源,为挖掘有应用潜力的深海冷泉微生物提供了保障。硫代硫酸盐是硫元素循环过程中重要的中间代谢产物,能够被多种微生物利用。我们从冷泉沉积物中获得了两株能够氧化硫代硫酸钠产生单质硫的细菌:赤杆菌（E.flavus 21-3）和硫氧化细菌G.hydrothermalis SP-2。结合南海冷泉区存在大量单质硫的事实,我们重点研究了这两株细菌代谢硫代硫酸钠产生单质硫的作用机制。针对赤杆菌（E.flavus 21-3）,我们深入研究了其代谢硫代硫酸钠产单质硫的分子机制。首先通过电子显微镜、能谱扫描和拉曼光谱确定E.flavus 21-3可以代谢硫代硫酸钠产生零价单质硫（zero-valent sulfur,ZVS）。结合蛋白质组和分子遗传学实验确定硫代硫酸根脱氢酶（thiosulfate dehydrogenase,Tsd A）和硫氧化蛋白（thiosulfohydrolase,Sox B）是E.flavus 21-3代谢硫代硫酸钠产单质硫的关键蛋白。通过化学计量方法检测了不同的含硫中间代谢产物,进而确定Tsd A负责将硫代硫酸根转化为连四硫酸根（-O3S-S-S-SO3-）;Sox B负责水解连四硫酸根的磺酸基形成单质硫;单质硫在单质硫双加氧酶（sulfur dioxygenases,Sdo A/B）的作用下水解生成亚硫酸根。另外,Tsd A、Sox B和Sdo A/B同源序列广泛存在于包括赤杆菌在内的许多细菌基因组中。表明这种新型硫代硫酸钠氧化途径可能存在于多种微生物当中,并且在硫的生物地球化学循环过程中有重要作用。针对化能自养硫氧化细菌G.hydrothermalis SP-2,结合能谱扫描、拉曼光谱和基因组测序,我们对其参与硫元素循环进行了初步分析。基因组测序结果显示,G.hydrothermalis Sp-2基因组大小为2.59 M,G+C含量为66.89%。G.hydrothermalis SP-2具有sox AXBYZC操纵子,通过经典的Sox多酶复合物途径氧化硫代硫酸钠。由于缺少sox D基因,G.hydrothermalis SP-2氧化硫代硫酸钠过程中形成单质硫中间代谢产物。另外,G.hydrothermalis SP-2通过磷酸戊糖途径固定二氧化碳,并利用羧酶体提高固碳效率。