多酶法生物合成被称为第三代生物催化,包括体外的多酶法和体内的多酶法。它已经被广泛应用于手性化学品的不对称合成,包括级联反应和偶联反应,如辅酶的原位再生等。手性p-羟基腈是医药与化工行业中的重要中间体。目前,用于制备手性p-羟基腈的生物催化方法主要有两种：动力学拆分和不对称合成。其中,采用氧化还原酶-卤代醇脱卤酶多酶法催化的级联反应,能以价格相对便宜的潜手性的卤代酮为出发底物,不对称合成手性p-羟基腈,理论转化率可达到100%,具有明显的优势。然而,目前这方面的研究都是在体外进行的。由于不同酶的适宜催化条件不同,致使该工艺的转化效率不高。另外,体外的多酶法催化需要人为添加昂贵的辅因子,如NAD(P)+等,增加了反应的成本,且需要对各个酶分别表达和纯化,过程也较麻烦。由于体内的多酶法不需要分别表达和纯化酶蛋白,且容易实现辅酶的原位再生,既能简化操作过程,也能降低反应成本。而且,细胞的稳态内环境还有利于酶的稳定,使不同的酶能在同一个细胞内更好地发挥功能。因此,采用体内的多酶法,能够弥补体外多酶法的不足,进一步提高生物催化级联反应或偶联反应的效率。本文通过氧化还原酶和卤代醇脱卤酶在Escherichia coli中的共表达,首次使用一菌多酶法,以卤代酮为出发底物,制备手性β-羟基腈。该方法操作方便,底物较便宜,转化率可达100%,部分产物ee值大于99%。并通过引入辅酶再生酶和多酶共表达策略的优化,实现了辅酶NADPH和NADH的高效原位再生,并使Eco_RBH多酶体系中各酶的活力达到平衡,有效提高了多酶体系的催化效率。同时,首次揭示了卤代醇脱卤酶HHDH活力受COBE(4-氯乙酰乙酸乙酯)抑制的机理：COBE与HHDH活性中心的Ser132和Tyr145结合,占据了该酶的催化活性位点。该抑制作用为竞争性可逆抑制。基于以上抑制机理,通过突变筛选,获得了阳性突变株F136V/W249F,其COBE半抑制浓度是HHDH(wild-type)酶的20倍。另外,首次以6-氯3,5-二羰基己酸叔丁酯为底物,经过三步酶促反应,合成了阿托伐他汀的关键中间体——(3R,5R)6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。一、利用源于Lactobacillus kefiri DSM 20587的醇脱氢酶AdhR和AdhS具备的不同选择性,结合源于Agrobacterium radiobacter AD1的卤代醇脱卤酶HheC,构建了两个氧化还原酶-卤代醇脱卤酶组合的一菌双酶体系AdhR-HheC和AdhS-HheC,并以4-氯乙酰乙酸乙酯为模型底物,一锅法制备了手性的4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(HN)。两个体系具有相反的选择性。在此基础上,通过研究AdhR和AdhS的辅酶再生,引入葡萄糖脱氢酶GdhBS和甲酸脱氢酶FdhCB,按照不同共表达策略(单质粒或双质粒),分别建立了两个一菌多酶体系AdhR-GdhBS-HheC和AdhS-FdhCB-HheC,并实现了多酶的均衡表达。与一菌双酶体系相比,一菌多酶体系的羰基还原活力得到了提高。再利用催化活力较高的卤代醇脱卤酶HHDH(F136V/W249F)替换两个一菌多酶体系中的HheC,提高了脱卤氰化的反应活力,构建了工程菌Eco_RBH和Eco_SFH。前者催化COBE底物到R)-HN的级联反应,第一步反应活力195 U/L,第二步反应活力184 U/L；后者催化COBE底物到(R)-HN的级联反应,第一步反应活力18.1 U/L,第二步反应活力107 U/L。考察了工程菌Eco_RBH和Eco_SFH的4℃储藏稳定性,37℃操作稳定性及重复利用稳定性,发现一菌多酶的全细胞体系比粗酶液体系具有更好的稳定性,且可以被重复利用。分析了HheC、HHDH、AdhR和AdhS酶的底物谱。在此基础上,利用一菌多酶体系Eco_RBH成功制备两个手性p-羟基腈产品：(R)-HN和(S)-3-羟基苯丙腈。两者ee值都大于99%。利用一菌多酶体系Eco_SFH成功制备两个手性p-羟基腈产品：(回-HN和(R)-3-羟基苯丙腈。前者ee值为60.2%,前者ee值为93.2%。二、克隆表达了卤代醇脱卤酶HHDH。测得该酶催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)反应的比活力为3408 U/g,催化(R)-CHBE反应的比活力为3712 U/g。发现HHDH受COBE活力抑制严重,COBE对HHDH的半抑制浓度约为10μM。进而研究了HHDH受COBE活力抑制动力学。结果表明,该抑制作用是竞争性的可逆抑制。通过分子模拟分析和计算,揭示了COBE抑制HHDH的机理：COBE分子能结合到HHDH的活性中心,并与Ser132和Tyr145形成氢键,阻碍反应底物与酶催化残基的结合。结合能计算结果也表明,COBE与HHDH的结合能力较强,超过了反应底物(S)-CHBE。通过在HHDH活性中心附近和底物通道入口处的氨基酸,分别进行饱和定点突变。筛选得到两个阳性突变体W249L和F136L。在249位和136位氨基酸同时引入饱和定点突变,筛选得到了一个阳性突变体F136V/W249F。 COBE对突变体F136V/W249F的半抑制浓度约为200μM,是HHDH (wild-type)的20倍。三、在摇瓶中对工程菌Eco_RBH的发酵培养基进行了优化,使用工业级的培养基替换了LB培养基。利用工业级培养基,在摇瓶中对工程菌Eco_RBH的发酵表达条件进行了优化。优化后工程菌Eco_RBH的第一步反应活力为857.9 U/L,同时第二步反应活力为932.3 U/L,约为LB培养基中催化活力的4倍。然后,研究了工程菌Eco RBH在15L发酵罐上的高密度发酵工艺。通过补料分批发酵,使菌体干重达到20.44g/L,第一步反应活力为8620 U/L,第二步反应活力为8587 U/L,约为摇瓶培养最佳催化活力的10倍。研究了工程菌Eco_RBH催化反应时,温度和pH值等因素的影响。结果表明,最佳的反应温度为30℃,最佳的反应pH值为7.0。研究了工程菌Eco_RBH在提高底物浓度时的催化反应。以高密度发酵所得Eco_RBH菌体为催化剂(细胞负载量为20 g干细胞/L),投入100 mM的COBE反应,2h后可以被完全转化为(R)-HN。而投入100 mM的2-氯苯乙酮反应,1h后可以被完全转化为(S)-3-羟基苯丙腈。四、利用工程菌BL21_pACYCDuet-AdhR,以6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯为底物,合成了(S)-6-氯-5-羟基-3羰基己酸叔丁酯。产物ee值大于99%。催化活力约为12 U/L。利用源于Candidia magnoliae的羰基还原酶Cr和葡萄糖脱氢酶GdhBS,构建工程菌BL21_pACYCDuet-CB,以(S)-6-氯-5-羟基-3羰基己酸叔丁酯为底物,合成了(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。产物de值约98.2%。催化活力约为35 U/L。利用AdhR、Cr和GdhBS,构建了工程菌Eco_RCB,并成功用于以6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯为底物,制备他汀类药物的关键中间体(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的反应,催化活力约为11 U/L。利用卤代醇脱卤酶HHDH,构建了工程菌Eco H,并成功用于制备他汀类药物的关键中间体(3R,5R)6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的反应。该步反应活力约为21.4 U/L。