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胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(Solutecarrierfamily7member11,Slc7a11)属于溶质转运第7家族的第11个成员,编码胱氨酸/谷氨酸xCT运载体,控制褐黑色素合成从而影响真黑色素与总黑色素的比例,改变动物的毛色和肤色。课题组前期研究中,发现Slc7a11基因在不同毛色獭兔皮肤中表达存在显著差异,推测其可能参与到獭兔皮毛色素沉积过程。为了进一步探究Slc7a11在色素沉积中的分子调控机制,本研究分离并鉴定了兔黑色素细胞,利用荧光定量及Wes全自动蛋白质印迹定量分析等技术手段分析了 Slc7a11在獭兔不同毛色皮肤中的表达规律,并通过双荧光素酶和EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assays)实验验证了转录因子 POU2F1 又名 Oct-1(Octamer Transcription factor-1)对 Slc7a11 基因启动子的转录激活有重要的调控作用。该研究结果为拓展Slc7a11在獭兔皮毛黑色素沉积中的功能,深入解析被毛色素沉积机理提供研究基础。主要研究结果如下:1、首次分离并鉴定了兔黑色素细胞,为本研究的开展提供实验素材。采集黑色獭兔背部皮肤,利用两步酶消化法分离兔黑色素细胞,发现其呈现特有的两极树突状,且具有特殊的生长晕、折光性强。Real-time-PCR检测黑色素细胞标志基因MITF、TYR、TYRP1,发现其均有表达。利用左旋多巴(L-DOPA)染色方法对分离的黑色素细胞进行染色,发现细胞中呈现棕色或者黑色颗粒。进行S-100、TYR、TYRP1的免疫细胞化学染色,发现3种标记物在黑色素细胞内均有表达,与阴性对照相比,S-100染色显示胞质及树突呈棕色阳性着色,TYR染色细胞核内为棕黄色,TYRP1呈现浅棕着色,均为阳性,说明成功分离和鉴定了兔黑色素细胞。2、利用RACE和克隆技术获得Slc7a11 cDNA序列,包括31bp 5’UTR、1509bp的开放阅读框(ORF)和 132bp 3’UTRs(含 poly[A]tail),提交 GenBank(登录号为 KY971639.1)。通过免疫组织化学法分析Slc7a1 1蛋白在獭兔皮肤组织中的定位,结果显示S1c7a11在表皮、毛囊毛球部、毛根鞘均有蓝色阳性反应,着色深浅不等,表达部位较广泛。利用Real-time qPCR检测Slc7a11基因在不同毛色獭兔皮毛中的mRNA表达水平,发现其在蛋白黄色被毛皮肤中的表达量最高,是白色皮肤的3.7倍;利用Wes系统检测Slc7a11蛋白在各毛色皮肤组织中均有表达,但蛋白青色与蛋白黄色皮肤组织中的表达量高于其他毛色,提示Slc7a11与獭兔毛色形成相关。3、为进一步分析Slc7a11基因在黑色素生成过程中的作用机理,通过siRNA干扰与过表达技术,转染兔黑色素细胞,利用荧光定量PCR及Wes检测MITF、TYR等毛色相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现Slc7a11过表达或抑制时,色素生成密切相关的基因的mRNA和蛋白表达量也显著变化,mRNA和蛋白表达量呈显著正相关(P<0.05),与Slc7a11表达变化情况一致。通过酶标仪检测转染之后的黑色素细胞黑色素含量,发现Slc7a11过表达/抑制时,与对照组相比,黑色素含量增加/降低。由此得出,Slc7a11可影响TYR、MITF等色素沉积相关基因的表达,进而影响黑色素生成。4、为了进一步揭示Slc7a11基因的调控机制,克隆了 Slc7a11起始密码子前2499bp的启动子序列,首先通过预测分析Slc7a11启动子区域内潜在的转录因子,并据此构建了 10个系列缺失载体,转染RAB-9细胞,利用双荧光素酶报告系统检测发现Slc7a11启动子的核心区域为-769～-619bp,经预测发现该区域存在转录因子POU2F1结合位点。利用定点突变技术,将该结合位点进行有效突变,发现突变后Slc7a11启动子活性极显著上升(P<0.01),说明POU2F1对Slc7a11启动子活性有抑制作用。进一步利用竞争性EMSA实验,确认POU2F1蛋白可结合于Slc7a11启动子-713～-703bp区域调控Slc7a11启动子活性。