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实验一 异丙酚对NMDA致PC12细胞损伤的保护作用 目的：观察静脉麻醉药异丙酚对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）致PC12细胞损伤的保护作用，并进一步研究其产生保护作用的可能机理。方法：1．细胞培养：将分化的PC12细胞用DmeM完全营养液传代至96孔细胞培养板，用于细胞保护实验，测LDH浓度及存活细胞的吸光度值(OD570nm值)；传代至6孔细胞培养板，用于胞内钙离子浓度的测定；传代至直径为100mm的细胞培养皿中，用于一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的测定。传代后的PC12细胞放入CO2细胞培养箱中，在37℃，5％CO2条件下培养3～4天，培养期间换液1～2次。待细胞长满后用于分组实验。2．LDH及OD570nm值的测定：用半自动生化仪及MTT比色法分别测定乳酸脱氢酶（LDH）漏出浓度及存活细胞吸光度值(OD570nm值)，用于判断细胞损伤程度及活细胞数量，以此观察异丙酚对NMDA损伤PC12细胞的保护作用。3．Fura-2／AM荧光标记法测定NMDA处理及加用异丙酚12.5和125μmol·L-14h后细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化情况，观察异丙酚对NMDA处理PC12细胞后所致的细胞内Ca2+超载的影响。4．分光光度法测量NMDA及其与异丙酚12.5和125μmol·L-1共同处理4h后PC12细胞NOS活性的变化。根据已知公式计算出NOS，以此判断异丙酚对NMDA所致PC12细胞NOS活性增加的影响。结果：1．NMDA300μmol·L-1处理PC12细胞4h后，LDH漏出浓度较对照组明显增加，细胞存活率(OD570nm表示)明显下降（P＜0.01），提示细胞 军医进修学院硕士学位论文 受到损伤或邢分细胞死亡。异丙酚 1．56～400 11 molL”‘与 NMDA 300 卜mol工”‘共同作用细胞奶后，除1．56 v mol·L‘外，其他各浓度均有 显著的细胞保护作用，表现为细胞LDH释放量明显减少，OD刀加m 显著增加（＜O．mX异丙酚在mo v md·L’时保护作用已达到对照组 水平，继续增加至 400 p molL’，保护效应无明显变化。2．NMDA 300 pmol．L”‘作用 pC12细胞4h后，＊勺i较对照组明显升高。异丙酚 12．5和 125pm＊”’可明显降低 NMDA诱导的细胞内钙超载 （＜0．of）。但异丙酚两剂量组间无明显差异。3．N’MDA 300 P mol·L”’ 可显著增加 PC12细胞的 NOS活性，异丙酚 12．5和 125 p mol·L”‘则 可明显对抗NMD A所致的＊OS活性增加（＜0刀1）异丙酚两剂量组 间比较无明显差异。结论：1．NMDA 300 11m＊”‘可对 PC12细胞 造成明显的损伤，静脉麻醉药异丙酚6．25叶00 v mol工”‘对此损伤产 生明显的保护作用，且具有一定的剂量依赖性。2．异丙酚12．5和 125 P mol·L”‘可显著降低 NMDA诱导的 PC细胞内钙超载并可对 抗NMDA诱导的NOS活性的增加。提示静脉麻醉药异丙酚可能是 通过直接或间接对NMDA受体－CaZ”－NOS这一路径的抑制而产生细 胞保护效应。 关蹦：静脉麻醉药，双异丙酚；N－甲基－D－天冬氨酸；细胞，PC； 钙离子；一氧化氮合酶；保护作用，机制 实验H 咪哇安定对NMDA致PC12细胞损伤的保护作用 目的：探讨静嘛醉药咪哇安定对N－甲基－D－天冬氨酸o A） 致 PC细胞损伤的保护作用，并研究其可能的作用机理。方法：1．细 胞培养：同实验一。2．LDH及ODn。＿值的测定：用半自动生化仪 及MTT比色法分别测定LDH漏出浓度及存活细胞OD。，。呵值，以此 判断细胞损伤程度及存活细胞数量，用以探讨咪哇安定对NMDA所 致 P＊ 2细胞损伤的保护作用。3．Fura《咖荧光标i己法测定 NMDA 2 军医进修学院硕士学位论文及分别＃。H咪＆％x 3和 30 11 mol·L”‘4h后 PclZ细胞KJ勺；的变｛t情况，观察咪哇安定对 NMDA诱导的肚 12细胞内 C／”超载的影响。4．采用分光光度法测量 PC细胞 NOS活性的变化。＃瞄已知公式计算出 NOS，以此判断咪哇安定对 N’’MDA 300 11 mol·L’处理 PC12细胞4h后NOS活性变化的影响。结果：1．NMDA300卜m＊L”‘处理肚12细胞4h后，LDH漏出浓度较对照组明显增加，细胞存活率（0q，。＊＊明显下降（P＜o刀二）。咪哇安足o．33～30 p mo巨厂’与－A 30op mdl‘共同作用 4h后，除 o．33v OdL”’组外，其他各剂量组均有较好的细胞保护作用，表现为LDH明显降低，ODn加m显著增加（P＜0．of）。2．NMDA300 11 ＜OI·L”作用 PC12 细胞 4h后［Cd1较对照组明显升高，而咪哇安定3和 30 11 mol·L”’均可明显降低NMDA诱导的细胞内钙超载厌＜o刀1）咪哇安定两浓度组间＊勺；无明显差异。3．NMDA可显著增加 PC细胞的 NOS活性，咪哇安定 3和 3 0 vmo卜厂’则可明显对?