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目的观察TCDD诱导小胶质细胞炎性激活及继而引发神经元凋亡的作用机制。方法1.本实验拟采用HAPI小胶质细胞观察TCDD诱导小胶质细胞炎症激活。(1)首先采用半定量逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测10 nmol/ml(nM)TCDD诱导的HAPI小胶质细胞细胞因子TNF-α时间效应关系(0.5、1、3、4、6、12 h)和IL-1βm RNA表达水平以及利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)观察两者分泌水平改变。(2)利用半定量RT-PCR观察TCDD诱导非基因通路两种主要激酶cPLA2和COX-2 mRNA表达水平变化。(3)利用蛋白免疫印迹(Western blot)检测TCDD引起的HAPI细胞的总蛋白中IκBα、p-IκBα和p-p65的蛋白水平变化,为进一步确证NF-κB通路的激活,核浆分离后分别检测TCDD诱导HAPI细胞后其核内和胞浆内p65的变化,并用细胞免疫荧光检测在正常和TCDD刺激下p65入核情况。2、为了研究小胶质细胞活化后对神经元的影响,本实验主要研究被公认的小胶质细胞分泌的一氧化氮(NO)对原代神经元影响机制。(1)利用半定量rt-pcr和westernblot分别检测inos的mrna水平和蛋白质的表达水平变化,利用griess法检测tcdd刺激hapi细胞后引起no分泌的剂量效应(0.01、0.1、1、10、50、100nm)和时间效应(0.5、1、3、4、6、12h)关系。westernblot检测引起no释放的主要信号通路mapks各蛋白(p38、jnk、erk)的变化情况。(2)利用tcdd诱导hapi细胞激活后的条件培养基(cm)培养大鼠原代神经元细胞,运用细胞计数试剂盒(cellcounterkit-8,cck-8)和乳酸脱氢酶释放(ldhrelease)试剂盒检测不同时间点(0.5、1、3、4、6、12h)cm对原代神经元细胞活力和细胞毒性作用影响。运用末端脱氧核苷酰基转移酶介导的dutp切口末端标记(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediatedbiotinylated-dutpnick-endlabeling,tunel)染色检测炎性活化的hapi细胞cm对原代神经元凋亡的作用。(3)加入mapks信号通路抑制剂预处理hapi细胞,运用westernblot和griess方法分别检测对tcdd诱导的mapks信号通路蛋白表达和no释放的改变,以及利用rt-pcr和westernblot检测对诱导no合成inos的变化。同时运用cck-8和ldh试剂盒检测分别检测抑制剂预处理后的hapi细胞cm对原代神经元细胞活力和细胞毒性作用改变。最后,用tunel染色检测抑制剂预处理后的hapi细胞cm对原代神经元凋亡作用的影响。结果1、(1)rt-pcr和elisa结果显示,与对照组(dmso)相比,10nmtcdd能够诱导hapi细胞以时间依赖方式转录和分泌tnf-α,在3h与对照组相比显著增加(p<0.05),并在4h达到高峰。同时,il-1β转录和分泌也增加。(2)rt-pcr结果显示,10nmtcdd能够诱导hapi细胞非基因通路激酶cpla2和cox-2的转录水平增加,并分别在0.5h和1h明显升高(p<0.05)。(3)westernblot结果显示,10nmtcdd可以诱导hapi细胞nf-κb信号通路激活,包括iκb磷酸化和泛素化降解,p65磷酸化,同时核浆分离结果显示,核内p65增加,胞浆内p65明显减少。细胞免疫荧光结果表明hapi细胞在tcdd诱导下p65可以由胞浆转移入胞核。2、(1)rt-pcr和westernblot结果表明,10nmtcdd能够诱导hapi细胞inos的转录水平和蛋白水平以剂量依赖和时间依赖方式增加。griess方法检测结果显示tcdd能够诱导hapi细胞以剂量依赖和时间依赖方式释放NO,并可随着时间延长增多。Western blot结果也显示,调控iNOS表达并引起NO合成增加MAPKs中的p38和JNK表达水平明显增加,但ERK没有发生明显变化。(2)CCK-8和LDH释放试剂盒分析结果显示TCDD刺激过的HAPI细胞的CM能够引起大鼠原代神经元细胞活力降低和LDH释放增加。同时TUNEL染色也证实了该CM可以引起大鼠原代神经元细胞发生明显凋亡。(3)分别加入p38 MAPK和JNK抑制剂SB202190和SP600125预处理HAPI细胞后,Western blot和Griess法分别证实TCDD诱导的p38 MAPK和JNK的磷酸化激活和NO升高被抑制。RT-PCR和Western blot也显示iNOS的转录和蛋白表达的增多也被抑制。CCK-8和LDH释放试剂盒也显示CM诱导的大鼠原代神经元细胞活力下降和LDH释放也被抑制,最后,TUNEL染色发现CM诱导的原代神经元TUNEL阳性细胞增多也明显被抑制。结论1、(1)TCDD能够引起HAPI小胶质细胞的炎性激活,并且释放TNF-α、IL-1β等细胞因子;(2)TCDD可经过非基因通路迅速激活cPLA2和COX-2等激酶;(3)TCDD可以诱导HAPI细胞NF-κB信号通路激活。2、(1)TCDD诱导HAPI小胶质细胞p38 MAPK和JNK信号通路诱导iNOS激酶增加并从而诱导NO合成增加;(2)小胶质细胞炎性激活释放的NO能够引起原代神经元损伤,甚至凋亡;(3)抑制p38 MAPK和JNK信号通路可以抑制NO释放,从而抑制小胶质细胞炎性激活引起的原代神经元损伤和凋亡。