肠炎沙门菌是一种革兰阴性、无宿主特异性、兼性厌氧的胞内寄生菌,食用被肠炎沙门菌污染的禽类制品和蛋制品一直是食物中毒暴发的主要原因之一,严重危害人类公共卫生安全。近年来,尽管人们已经采取了一系列的预防措施,但仍然无法阻止肠炎沙门菌成为导致人沙门菌病的主要血清型沙门菌。因此,深入了解肠炎沙门菌致病机制和宿主抗感染免疫机制,开发针对肠炎沙门菌感染的新型防控和治疗措施显得尤为重要。经胃肠道入侵宿主机体后,肠炎沙门菌通过肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）和M细胞突破上皮屏障,并入侵附近的吞噬细胞扩散至系统部位。肠炎沙门菌入侵宿主细胞的能力主要依赖于致病岛（Salmonellapathogenicity island,SPI）-1编码的三型分泌系统（typethreesecretionsystem,T3SS）-1。进入宿主细胞内的肠炎沙门菌利用 SPI-2 编码的 T3SS-2 建立 SCV（Salmonella-containing vacuole）,并在其中复制存活。肠炎沙门菌可通过T3SS分泌60余种效应蛋白,用于维持SCV稳态,调节宿主细胞进程,逃避宿主免疫杀伤机制,以实现持续性感染。在肠炎沙门菌感染过程中,胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）,如NOD样受体（NOD-likereceptors,NLRs）能够识别肠炎沙门菌保守的的病原相关分子模式（pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs）,如鞭毛蛋白和 T3SS等,随后向下游招募接头蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）和效应蛋白Caspase-1前体蛋白（pro-Caspase-1）组装形成炎症小体。炎症小体激活后,pro-Caspase-1发生自裂解活化形成具有活性的Caspase-1,进而剪切下游的白细胞介素（interleukin,IL）-1β前体蛋白（pro-IL-1β）和pro-IL-18,释放促炎性细胞因子IL-1β和IL-18,Caspase-1/4/5/11 能够剪切成孔蛋白 Gasdermin D（GSDMD）,诱导细胞发生一种名为细胞焦亡的促炎性细胞程序性死亡。炎症小体激活介导的促炎性细胞因子的分泌和细胞焦亡在抵御沙门菌感染过程中的关键作用已逐渐被人们所认知,然而沙门菌也在长期进化的过程中形成了多种抑制炎症小体活化的策略。然而目前人们对沙门菌如何调控炎症小体活化,以逃避宿主免疫系统的清除形成持续性感染的认知依然十分有限。为了排除鞭毛蛋白这一NLRC4强激活剂可能带来的干扰,本研究以肠炎沙门菌鞭毛蛋白缺失株C50336ΔfliC（简称ΔfliC）作为亲本株,构建并筛选了ΔfliC转座子突变体库,旨在全基因组范围内筛选并鉴定肠炎沙门菌调控炎症小体活化的关键基因,并阐明其调控炎症小体活化以逃避宿主免疫清除的分子机制,为肠炎沙门菌新型防控和治疗措施的建立提供新的见解和思路。1 肠炎沙门菌调控炎症小体活化关键基因的筛选与鉴定首先以接合转移的方式将TnpSC189转座子随机插入至ΔfliC基因组中,成功构建ΔfliC转座子随机插入突变体文库。在小鼠巨噬细胞系J774A.1模型中,通过检测各细菌诱导的细胞毒性水平对肠炎沙门菌潜在的调控炎症小体活化的关键基因进行高通量筛选。第一轮共筛选了 3409株ΔfliC转座子突变株,其中有43株突变株诱导的细胞毒性水平显著性升高,72株突变株诱导的细胞毒性水平显著性降低。第二轮筛选对这115株突变株诱导炎症小体活化的能力进行了考察,共发现4株突变株诱导的Caspase-1活化和IL-1β表达水平显著性高于ΔfliC。基因定位结果显示,其转座子分别插入了siiDs、iiC、sifA和rcsD基因。随后分别构建了相应的基因缺失株,并对其诱导炎症小体活化的能力进行鉴定,结果显示rcsD、sifA和siiD因缺失株诱导的细胞毒性、IL-1β表达水平和Caspase-1活化水平均显著性高于ΔfliC,表明肠炎沙门菌感染宿主细胞期间能通过rcsD、sifA和siiD基因抑制炎症小体激活。本研究选择了抑制炎症小体活化效应最显著的siiD作为后续研究的目标基因,并构建了siiD基因回补株ΔfliCΔsiiD::siiD和空载体回补株ΔfliCΔsiiD::Vector。感染实验结果显示ΔfliCΔsiiD::Vector和ΔfliCΔsiiD一样,能够诱导更为强烈的细胞毒性、IL-1β分泌和Caspase-1激活,而ΔfliCΔsiiD::siiD诱导的炎症小体活化则恢复到了与ΔfliC相似的水平,且各株细菌诱导的非炎症小体依赖型炎性细胞因子IL-6的表达水平均无明显差异,表明SiiD特异性抑制了巨噬细胞中炎症小体的激活。随后构建重组原核表达菌株BL21-pGEX-6p-1-siiD,表达并纯化了 SiiD-GST重组蛋白,以在小鼠模型中制备SiiD多克隆抗体血清。细菌中SiiD的表达水平检测结果显示,亲本株ΔfliC能够表达少量的SiiD蛋白,siiD回补株能够表达大量SiiD蛋白,而siiD缺失株和空载体回补株样品中均无法检测到SiiD蛋白。2肠炎沙门菌T1SS蛋白SiiD的鉴定和功能研究分别制备并感染野生型（WT）、Nlrp3-/-、Nlrc4-/-和Casp1-/-小鼠骨髓来源原代巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDMs）,结果显示在 WT-和Nlrc4-/--BMDMs中,ΔfliCΔsiiD诱导的Caspase-1活化、细胞毒性和IL-1β分泌水平均显著性高于ΔfliC。然而在Nlrp3-/--和Casp1-/--BMDMs中,ΔfliCΔsiiD与ΔfliC诱导炎症小体激活的能力无明显差异,表明SiiD能够在肠炎沙门菌感染期间特异性抑制NLRP3-Caspase-1依赖性炎症小体的激活。随后本研究对SiiD能否在细菌感染期间被转运至宿主细胞内进行了考察。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）实验结果显示,对照组和ΔfliC-pCX340感染组细胞均呈现绿色,而ΔfliCΔsiiD-pCX340-siiD感染组的部分HeLa细胞呈现蓝色荧光。间接免疫荧光实验结果显示,只有在ΔfliCΔsiiD::siiD-HA感染的HeLa细胞中能观察到SiiD-HA聚集形成的绿色荧光斑点,而在ΔfliCΔsiiD::Vector感染组和对照组细胞中观察不到,这些结果说明SiiD蛋白能够在沙门菌感染期间被转运至宿主细胞内。随后将沙门菌感染的HeLa细胞裂解,通过超速离心分级分离获得细胞膜组分和胞质组分,SiiD胞内转运的亚细胞定位结果显示,被转运至胞内的SiiD蛋白定位于细胞内膜。为了进一步验证SiiD的胞内转运是否依赖于沙门菌T3SS或一型分泌系统（Type one secretion system,T1SS）,本研究分别构建了 T3SS-1、T3SS-2 和 T1SS 缺失株。FRET、间接免疫荧光和亚细胞定位实验结果显示,T3SS-1缺失后,SiiD的胞内转运能力明显降低;T3SS-2的缺失不影响SiiD的胞内转运和膜组分定位;然而在T1SS缺失的情况下,SiiD的胞内转运能力完全丧失。这些数据表明肠炎沙门菌感染宿主细胞期间,SiiD的胞内转运和膜组分定位均依赖于T1SS,部分依赖于T3SS-1,不依赖于T3SS-2。通过慢病毒感染的方式将SiiD异源表达于J774A.1细胞中,并以NLRP3炎症小体激活剂腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosinetriphosphate,ATP）、Nigericin和尿酸单钠晶体（monosodium urate crystals,MSU）代替肠炎沙门菌的感染,以考察SiiD蛋白能否独立调控NLRP3炎症小体激活。结果发现当细胞内表达SiiD蛋白时,ATP、Nigericin和MSU诱导的细胞毒性、Caspase-1活化以及IL-1β分泌水平均显著性低于对照组和Negative慢病毒感染组,表明SiiD蛋白能够独立抑制NLRP3炎症小体活化。3肠炎沙门菌T1SS蛋白SiiD抑制NLRP3炎症小体活化的机制为了探究肠炎沙门菌SiiD抑制NLRP3炎症小体活化的分子机制,本研究首先对SiiD是否参与调控NLRP3炎症小体各组分蛋白的表达进行了考察。结果发现siiD的缺失不影响受感染巨噬细胞中NLRP3、ASC、pro-Caspase-1和pro-IL-1β的表达。随后分别考察了 SiiD是否参与调控胞内K+外流、溶酶体裂解和活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成。结果显示,亲本株和siiD缺失株诱导的胞内K+和Ca2+流动以及溶酶体裂解水平均无明显差异,表明SiiD并不是通过影响胞内K+和Ca2+外流以及溶酶体破裂进而抑制NLRP3炎症小体激活的。而ΔfliCΔsiiD在巨噬细胞内诱导的线粒体ROS（mitochondrial ROS,mtROS）生成水平显著性高于ΔfliC,表明SiiD可能是通过阻断胞内mtROS生成以抑制NLRP3炎症小体激活。通过使用mtROS靶向清除剂Mitoquinonemesylate（MitoQ）预处理巨噬细胞,以进一步考察SiiD抑制NLRP3炎症小体是否是由抑制mtROS生成介导的。结果发现在未使用 MitoQ 处理的 BMDMs 中,ΔfliCΔsiiD和 ΔfliCΔsiiD::Vector 诱导的 mtROS 生成、Caspase-1活化、细胞毒性以及IL-1β表达水平均显著性高于ΔfliC和ΔfliCΔsiiD::siiD;然而在MitoQ预处理的BMDMs中,ΔfliCΔsiiD和ΔfliCΔsiiD::Vector诱导的高水平mtROS生成和炎症小体激活的现象均消失。在J774A.1细胞感染实验中也得到了一致的结果,表明肠炎沙门菌SiiD蛋白通过抑制胞内mtROS,从而阻断NLRP3炎症小体活化。ASC焦亡小体形成是NLRP3炎症小体激活的关键环节,本研究进一步考察了 SiiD是否参与调控ASC焦亡小体的形成。结果发现,在WT-、Nlrc4-/--和Casp1-/--BMDMs中,siiD缺失株诱导ASC焦亡小体形成的能力均显著性强于亲本株;然而在Nlrp3-/--BMDMs中,siiD缺失株和亲本株诱导的ASC焦亡小体形成的能力无明显差异,表明SiiD能够抑制NLRP3依赖型ASC焦亡小体形成,且该抑制作用不依赖于NLRC4和Caspase-1。不仅如此,在未使用MitoQ预处理的小鼠巨噬细胞中,与ΔfliC和ΔfliCΔsiiD::siiD相比,ΔfliCΔsiiD和ΔfliCΔsiiD::Vector诱导ASC焦亡小体形成的能力显著性增强。而MitoQ的处理强烈抑制了siiD缺失株和空载体回补株在巨噬细胞中诱导ASC焦亡小体形成的能力。这些数据表明,肠炎沙门菌在感染期间可利用SiiD抑制mtROS生成,进而阻断ASC焦亡小体形成,最终抑制NLRP3炎症小体激活。通过慢病毒感染实验考察SiiD能否独立调控胞内mtROS生成和ASC焦亡小体形成。结果发现与对照组和Negative慢病毒感染组相比,SiiD慢病毒感染组J774A.1细胞在ATP或Nigericin诱导下的mtROS生成、ASC焦亡小体形成和炎症小体活化水平均显著性降低。MitoQ的处理也能够强烈抑制ATP或Nigericin在对照组和Negative慢病毒感染组中诱导的高水平mtROS生成、ASC焦亡小体形成和NLRP3炎症小体激活。这些数据表明肠炎沙门菌T1SS蛋白SiiD能够独立地抑制宿主细胞中mtROS-ASC信号介导的NLRP3炎症小体活化。4 肠炎沙门菌T1SS蛋白SiiD减弱NLRP3炎症小体介导的体内细菌清除为了进一步阐明SiiD蛋白抑制NLRP3炎症小体激活对于肠炎沙门菌逃避宿主天然免疫应答机制的生物学意义,本研究将ΔfliC和ΔfliCΔsiiD以口服灌胃的方式分别感染WT-和Nlrp3-/--C57BL/6小鼠。与ΔfliC感染的WT小鼠相比,ΔfliCΔsiiD感染组小鼠体重下降的速率和幅度均明显降低,小鼠的存活时间明显延长。然而ΔfliC和ΔfliCΔsiiD感染的Nlrp3-/-小鼠体重的变化和存活时长均无明显差别,表明肠炎沙门菌SiiD在小鼠体内介导的毒力效应依赖于NLRP3。随后将ΔfliC和ΔfliCΔsiiD分别感染WT、Nlrp3-/-、Nlrc4-/-和Casp1-/-小鼠,测定小鼠血清中炎症小体依赖性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌水平,以考察SiiD是否能在小鼠体内抑制NLRP3炎症小体激活。实验结果显示,在WT和Mlrc4-/-小鼠体内,ΔfliCΔsiiD诱导的血清IL-1β和IL-18表达水平均显著性高于ΔfliC,表明SiiD在小鼠体内依然能够抑制炎症小体激活。然而在Nlrp3-/-和Casp1-/小鼠体内,ΔfliCΔsiiD和ΔfliC诱导IL-1β和IL-18表达水平无明显差异,表明肠炎沙门菌SiiD能够在小鼠体内特异性抑制NLRP3炎症小体的激活。不仅如此,在WT和Nlrc4-/-小鼠的脾脏和肝脏中,ΔfliCΔsiiD的定植量均显著性低于ΔfliC,表明肠炎沙门菌可通过SiiD抑制小鼠体内炎症小体的活化,以避免被宿主清除。然而,ΔfliCΔsiiD在Nlrp3-/--和Casp1-/--小鼠脾脏和肝脏中的定植量与ΔfliC相比均无明显差异,表明肠炎沙门菌在感染小鼠期间能够利用T1SS蛋白SiiD减弱NLRP3炎症小体介导的细菌清除机制,实现免疫逃避。总而言之,本研究首次发现肠炎沙门菌在感染宿主细胞过程中,可将T1SS蛋白SiiD转运至宿主细胞内,特异性抑制胞内mtROS生成,以进一步阻断ASC焦亡小体形成,最终抑制NLRP3炎症小体激活。肠炎沙门菌可利用SiiD特异性抑制小鼠体内NLRP3炎症小体激活,以逃避NLRP3-Caspase-1介导的细菌清除机制,促进细菌在机体内的复制存活,以形成持续性感染。