水稻转录因子OsMADS34对microRNA396b调控的初步研究

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Micro RNA(mi RNA)的长度约为21nt,是一种非编码的小分子RNA。它可以特异识别靶m RNA,并且可以与之结合,从而达到切割靶m RNA,并且抑制其后续翻译、甲基化的功能。通过这一系列操作,会对基因的表达产生负向的调控作用。作为全球主要的粮食作物之一,水稻的产量则对全球的粮食安全起到直接影响作用。随着对mi RNA研究的深入,增强了研究人员对基因调控机制的理解,并通过其调控机制展现了植物细胞内基因表达多层次、全方位的调控系统。MADS-box家族是一类重要的转录调控因子,在水稻生长发育过程中参与调控许多方面。根据蛋白质结构域的不同,MADS-Box家族基因可以分为Type I和Type II这两种类型。而在水稻中,这两种类型均存在。前期实验室的孙亨利用酵母单杂交试剂盒构建了较高质量的c DNA文库,并构建了Osmi R396b启动子诱饵质粒进而筛选到了Os MADS34以及一些其它可能与其启动子作用的相关因子。本文拟通过启动子活性检测、酵母单杂、亚细胞定位及EMSA等实验,对Os MADS34对Osmi R396b启动子区域产生的调控作用进行深层的研究。通过本文的研究,希望为后续的Os MADS34-Osmi R396b调控通路的阐明奠定基础,并且在此基础上进一步提高水稻产量。具体研究结果如下:通过采用酵母单杂回复验证,确定了Os MADS34可以与Osmi R396b启动子元件结合。通过将截短后的目片段再次构建至载体上进行酵母单杂实验,将Os MADS34中发挥作用的关键Domain定位为MADS-Domain,并随后再次截短至Os MADS3488-147.通过软件分析及酵母单杂实验,确定Osmi R396b启动子区域的核心基序为CACCAACC。通过点突变后的三次串联,将核心碱基定位为C。利用水稻原生质体转化的方法,将Osmi R396b启动子区域构建至合适的载体上并进行亚细胞定位。在显微镜下观察的结果显示,Os MADS34是一个定位于细胞核内的转录因子。而启动子活性检测、烟草GUS染色的实验验证了在体系内加入Os MADS34后,可以增强Osmi R396b启动子的活性。在体内进行了Os MADS34的敲除及过表达的转基因实验,最终获得了阳性植株。
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