帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球第二大与老化相关的神经退行性疾病,多种综合性因素参与PD的发生发展,然而其确切病理机制尚未完全阐明。PD主要病理特征为黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元进行性丢失及路易小体(Lewybody,LB)沉积,并伴有震颤麻痹等帕金森样运动症状和抑郁等非运动症状。目前对于PD尚无理想的治疗方法,依然沿用左旋多巴替代疗法缓解PD的运动症状,但无法延缓PD的病理进程,且长期应用还会引发一系列的副作用,甚至加重疾病进程。因此,阐明PD病理机制对于寻找有效缓解PD病程的治疗药物尤为重要。研究表明氧化应激、线粒体功能障碍、错误折叠蛋白积聚、兴奋性毒性、神经再生障碍、神经炎症等病理机制协同参与PD病理进程中DA能神经元进行性丢失的过程。PD病理早期即可出现神经炎症反应,且炎症反应过程中不同神经细胞释放的细胞因子可作为早期诊断PD的生物学指标。研究表明星形胶质细胞释放的促炎因子白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)在PD病理过程中发挥重要的调控作用,然而在动物模型上应用IL-1β受体拮抗剂并不能有效改善PD模型所致DA能神经元丢失的现象。因此,深入阐明PD病理过程中IL-1β或其他多种病理因素介导的星形胶质细胞神经炎症反应和DA能神经元损伤的确切病理机制,对于研发理想的PD神经保护剂和探索PD治疗新策略具有重大的科学意义。炎症反应的最初阶段涉及细胞内多种复合物的相互作用,这种多分子复合物组成的成分称为“炎症小体”。在2000年初,Tschopp和他的团队率先发现炎症小体,并意识到组织损伤可以诱发固有免疫应答从而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)依赖的炎性反应。炎症小体位于细胞质内,可以激活caspase家族,尤其是caspase-1,通过诱导caspase-1切割并释放IL-1β和IL-18等促炎因子,最终产生炎症反应。因此,炎症小体在固有免疫系统抵抗病理性刺激的过程中发挥重要的作用。已有文献报道,在中枢神经系统(Central nevous system,CNS)中,神经细胞表面均表达IL-1β和IL-18的受体,且不同类型的炎症小体在不同神经细胞中各司其职,发挥神经免疫炎症的调节功能,近期神经病理学研究者越来越关注炎症小体在神经炎症过程中所发挥的调节作用。炎症小体种类繁多,本实验室前期研究表明NOD样受体家族蛋白3(NOD-like recptor protein 3,NLRP3)炎症小体可能参与PD的发生过程,然而目前对于PD病理过程中炎症小体调节神经炎症的病理机制尚未阐明。在前期研究基础上,本文第一部分工作首先发现临床PD患者血清存在炎症小体激活的现象。应用野生型(Wild type, WT)小鼠建立急性和慢性1-甲基,4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)PD小鼠模型,提取血清和原代骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages, BMDM),并分离中脑、肝脏和脾脏组织,阐明不同炎症小体类型在不同组织中发挥各自侧重的作用,并发现NLRP3炎症小体在PD病理过程中发挥主要的调控作用。此外,应用立体定位在小鼠中脑黑质致密部(Substantia nigra compact, SNc)注射siRNA-mus-NLRP3以抑制中脑SNc区NLRP3蛋白的表达,发现siRNA-mus-NLRP3可抑制MPTP诱导的DA能神经元损伤和胶质细胞增殖活化的现象,从整体水平阐述了NLRP3炎症小体与PD的相关性。在此基础上,第二部分工作应用PD模式动物一-Atp13a2基因缺失小鼠建立慢性MPTP/p PD小鼠模型,通过阐明Atpl3a2基因缺失诱导PD的病理机制的同时进一步确证了NLRP3炎症小体在PD病理损伤中的调控作用。结果显示,ATP13A2通过抑制星形胶质细胞NLRP3炎症小体的激活,抑制神经炎症反应从而延缓PD进程中DA能神经元损伤,发挥神经保护作用。该结果提示可通过靶向调控星形胶质细胞ATP13A2的表达或NLRP3炎症小体的激活,调节PD病理进程中神经炎症反应的发生,为延缓PD病理进程抗炎药物的研发提供新的思路。由于DA能神经元进行性丢失是PD病理进程中本质的特征,延缓DA能神经元退行性变是PD重要的治疗手段。因此,第三部分工作应用caspase-1基因缺失小鼠或caspase-1特异性抑制剂Z-YVAD,阐明caspase-1除了通过炎症小体激活介导神经炎症反应之外,还可通过调控caspase-7/PARP1/AIF信号通路直接影响DA能神经元的存活,为研发针对神经炎症和DA能神经元损伤的神经保护药物提供了新的药理学靶点。第一部分NLRP3-Caspase-1炎症小体与PD发生的相关性研究目的：研究炎症小体与PD发生的相关性及NLRP3炎症小体对PD神经损伤的影响。方法：ELISA检测正常人和PD患者血清中细胞因子caspase-1和IL-1β的分泌。应用3～4月龄雄性C57BL/6J小鼠分别建立急性和慢性MPTPPD模型,ELISA检测小鼠血清中细胞因子caspase-1和IL-1β的分泌；western blotting检测小鼠中脑组织中炎症小体活化产物蛋白procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的表达,同时检测小鼠中脑、肝脏、脾脏中NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRC4和AIM2(Absent in melanoma 2)炎症小体蛋白的表达。分离急性和慢性MPTP模型小鼠BMDM,western blotting检测BMDM中NLRP1、NLRP2、NLRP3、 NLRC4和AIM2炎症小体蛋白的表达：同时给予BMDM预孵育100ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)6 h,再分别给予不同炎症小体的特异性激活剂5mM ATP刺激30 min、10μg/ml flagellin刺激12h、转染10μg/ml MDP 18 h和2μg/ml dsDNA 48h后,ELISA检测BMDM细胞上清炎症因子IL-1β的分泌；western blotting检测BMDM中procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1p的蛋白表达。在小鼠中脑SNc区立体定位注射慢病毒包裹的NLRP3小干扰RNA(LV3-mus-Nlrp3)7天后建立急性MPTP模型,免疫荧光检测小鼠SNc区mus-Nlrp3-GFP绿色荧光蛋白表达,western blotting检测小鼠SNc区NLRP3蛋白的表达,酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫组织化学染色的方法检测siRNA-mus-Nlrp3对MPTP介导的中脑DA能神经元的影响、胶质源性纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein,GFAP)和离子钙接头蛋白(Ionized calcium binding adapter molecule 1, Iba-1)免疫组化检测siRNA-mus-Nlrp3对MPTP介导的中脑星形胶质细胞和小胶质细胞增殖活化的影响。结果：1)PD患者血清中caspase-1和IL-1β分泌水平较正常人显著增加,慢性MPTP/p PD模型小鼠血清和中脑组织中caspase-1和IL-1β表达水平显著上调；2)与生理盐水组相比,急性和慢性MPTP模型小鼠中脑组织中NLRP1和NLRP3蛋白表达显著上调；急性MPTP模型小鼠肝脏组织中NLRP2、NLRP3和NLRC4蛋白表达上调,而慢性MPTP模型小鼠肝脏中仅NLRP2和NLRP3蛋白表达上调：急性和慢性MPTP模型小鼠脾脏组织中NLRP3和AIM2蛋白表达上调；3)离体培养的急性和慢性MPTP模型小鼠的BMDM中,NLRP2和NLRP3蛋白表达显著上调；给予特异性炎症小体激活剂刺激后,ATP和flagellin均可诱导BMDM细胞中caspase-1和IL-1β蛋白表达上调,其中ATP作为NLRP3炎症小体激活剂所诱导的caspase-1和IL-1β表达上调的现象最为显著；4)小鼠中脑SNc区立体定位注射mus-Nlrp3-GFP后可在SNc区检测到绿色荧光蛋白表达,其中siRNA-mus-Nlrp3-2764可下调NLRP3蛋白表达,抑制率达63%；5)siRNA-mus-Nlrp3可显著抑制MPTP介导的中脑TH神经元的丢失；6)siRNA-mus-Nlrp3减轻MPTP诱导的中脑SNc区星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化。结论：1)PD病理条件下存在炎症小体激活的现象；2)NLRP3炎症小体是PD病理过程中发挥主要调控作用的炎症小体；3)siRNA-mus-Nlrp3减少MPTP诱导的DA能神经元丢失,抑制MPTP介导的中脑胶质细胞增殖活化,发挥神经保护作用。第二部分Atp13a2基因缺失在NLRP3-Caspase-1炎症小体激活介导的星形胶质细胞炎症反应中的作用及其机制目的；阐明星形胶质细胞ATP13A2抑制神经炎症反应的机制。方法:Western blotting方法观察慢性MPTP/p PD小鼠模型中脑组织中ATP13A2蛋白表达变化。剪取小鼠鼠尾并应用Real-time PCR及western blotting方法分别从基因和蛋白水平鉴定Atp13a2基因敲除小鼠。应用3～4月龄雄性Atpl3a+/+和Atp13a2-/-小鼠建立慢性MPTP/p PD模型,高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测小鼠纹状体内单胺类递质和氨基酸的水平。应用组织透射电镜法观察Atpl3a2基因缺失对小鼠中脑组织溶酶体形态的改变。免疫荧光检测Atpl3a2基因缺失对小鼠中脑自噬标志物LC3斑点积聚的影响,同时应用western blotting方法观察自噬信号通路中LC3和p62蛋白的表达以及自噬底物a-synuclein的表达变化。应用转棒、爬杆和开场的行为学检测手段评价Atp13a2基因缺失对MPTP/p所致运动功能障碍的影响。应用免疫组化染色方法检钡Atp13a2基因缺失对TH标记的DA能神经元形态和数目的改变,并结合体视学计数系统进行定量分析,同时采用western blotting方法检测小鼠中脑组织中TH蛋白的表达。免疫荧光双标法观察两种基因型小鼠中脑组织中TH神经元和a-synuclein的共定位、TH神经元和在体活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的共定位。GFAP和Iba-1免疫组化观察Atp13a2基因缺失对MPTP/p所致星形胶质细胞和小胶质细胞增殖活化的影响,并结合体视学观察胶质细胞形态的改变和定量计数各自细胞数目。Western blotting方法检测小鼠中脑组织中NF-κB信号通路相关蛋白p-IKKβ和p65的表达,同时检测炎症小体活化第二信号中相关蛋白NLRP3、procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的表达。离体培养新生1～3天Atp13a2+/+和Atpl3a2-/-小鼠中脑原代星形胶质细胞,同时应用Real-time PCR及western blotting方法检测星形胶质细胞中ATP13A2的表达。给予Atpl3a2+/+小鼠星形胶质细胞50μM MPP+刺激48 h后,收集细胞蛋白,western blotting方法检测MPP+对ATP13A2蛋白表达的影响。应用H2DCF-DA荧光探针检测Atpl3a2基因缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞内ROS生成的影响。Real-time PCR检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、1L-10和营养因子GDNF、FGF2水平的影响。给予两种基因型小鼠原代星形胶质50μM MPP+刺激48 h后,收集细胞上清,给予WT小鼠原代中脑神经元(星形胶质细胞上清与神经元培养基1：2混合)孵育6 h,TH免疫组化观察星形胶质细胞上清对中脑DA能神经元数目及轴突长度的影响。通过给予两种基因型原代星形胶质细胞不同炎症小体的特异性激活剂,ELISA检测星形胶质细胞上清中炎症因子IL-1β的分泌。给予两种基因型原代星形胶质细胞50μM MPP+刺激1.5、3、6、12、24 h后western blotting方法检测炎症小体活化的第一信号(NF-κB信号通路)相关蛋白p-IKKβ和p65的表达；MPP+刺激3、6、12、24、48 h后检测炎症小体活化的第二信号相关蛋白NLRP3、 procaspase-1、caspase-1、proIL-ip和IL-1β的表达。应用小干扰RNA技术(ATP13A2-siRNA,100 nM)干扰WT小鼠原代星形胶质细胞ATP13A2蛋白表达,收集细胞上清和胞浆蛋白,western blotting方法检测细胞上清IL-1β的分泌和胞浆中NLRP3、procaspase-1、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的蛋白表达。Western blotting和免疫荧光方法观察两种基因型星形胶质细胞或干扰ATP13A2蛋白表达的WT星形胶质细胞中给予MPP+刺激后组织蛋白酶B(Cathepsin B)的表达情况。两种基因型小鼠中脑原代星形胶质预孵育cathepsin B活性抑制剂Z-FA-FMK20 μM 1 h后,给予50μM MPP+刺激48 h并收集细胞上清和胞浆蛋白,western blotting方法检测炎症小体活化的第二信号相关蛋白caspase-1和IL-1β的表达情况。在两种基因型原代星形胶质细胞上转染pcDNA3.1 (-)-V5-ATP 13 A2质粒,收集细胞上清,ELISA方法检测ATP13A2过表达对星形胶质细胞释放TNF-α和IL-1β的影响,并用western blotting方法检测胞浆中ATP13A2、cathepsin B、 p-IKKβ-、p65、NLRP3、caspase-1、proIL-1β和IL-1β蛋白的表达。结果：1)MPTP/p PD模型小鼠中脑ATP13A2蛋白表达水平降低至对照组的58%；2)Atp13a2基因缺失诱导小鼠中脑组织溶酶体膜破裂、溶酶体结构完整性受损,并促进MPTP/p诱导的自噬功能障碍、增加中脑组织中a-synuclein蛋白的表达；3)Atp13a2基因缺失显著抑制纹状体中多巴胺及其代谢产物的基础水平；并可抑制纹状体中天冬氨酸和γ-氨基丁酸的释放水平、促进L-丝氨酸的释放水平,而对其它氨基酸基础状态下的释放水平并无显著影响；4)Atp13a2基因缺失诱导小鼠运动功能障碍；5)Atp13a2基因缺失诱导小鼠中脑SNc区TH神经元的丢失,进一步促进MPTP/p诱导的TH神经元内a-synuclein的积聚和ROS的生成；6)Atpl3a2基因缺失诱导小鼠中脑SNc区星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化；7)Atp13a2基因缺失加重MPTP/p诱导的中脑NLRP3炎症小体的激活；8)原代星形胶质细胞中表达ATP13A2蛋白；给予WT星形胶质细胞50μM MPP+刺激48 h,可显著下调星形胶质细胞中ATP13A2蛋白的表达；9)Atp13a2基因缺失加重MPP+诱导的星形胶质细胞内ROS的生成；并进一步促进MPP+介导的促炎因子的转录水平、抑制抑炎因子和神经营养因子的转录水平,其中对IL-1β转录水平的调控最为显著；10)将MPP+(50μM)刺激的AtP13a2+/+和Atp13a2-/-的星形胶质细胞上清与WT小鼠中脑原代神经元共孵育,免疫组化显示Atp13a2基因缺失的星形胶质细胞上清可诱导WT小鼠TH神经元阳性细胞数目的减少及突起长度的缩短；11)给予两种基因型小鼠原代星形胶质细胞不同炎症小体特异性激活剂刺激,发现Atp13a2基因缺失主要诱导星形胶质细胞中NLRP3炎症小体的激活；12) Atp13a2基因缺失加重MPP+诱导的NLRP3炎症小体激活的第一信号相关蛋白p-IKKβ和p65的表达增加；同时进一步促进MPP+诱导的NLRP3、caspase-1、proIL-1β和IL-1β的蛋白表达；13)给予WT小鼠中脑原代星形胶质细胞ATP13A2-siRNA(100nM)抑制星形胶质细胞中ATP13A2蛋白的表达,并可加重MPP+介导的NLRP3炎症小体的激活；14) Atpl3a2基因缺失或ATP13A2蛋白表达下调促进MPP+诱导的星形胶质细胞cathepsin B的表达;15)Cathepsin B抑制剂Z-FA-FMK可有效抑制Atpl3a2基因缺失或MPP+介导的NLRP3炎症小体的激活；16)星形胶质细胞过表达ATP13A2抑制Atp13a2基因缺失或MPP+诱导的星形胶质细胞cathepsin B蛋白表达上调和NLRP3炎症小体的激活。结论：1)Atp13a2基因缺失诱导中脑SNc区DA能神经元丢失并进一步加剧MPTP/p诱导的星形胶质细胞增殖活化；2)星形胶质细胞中表达ATP13A2,并参与神经毒素MPP+介导的病理反应；3)星形胶质细胞中敲除或敲减ATP13A2加剧MPP+诱导的NLRP3炎症小体活化,促进DA能神经元损伤；4)星形胶质细胞ATP13A2通过调节溶酶体cathepsin B的活性抑制NLRP3炎症小体的活化。第三部分靶向调控Caspase-1对DA能神经元损伤的影响及其机制目的：研究靶向调控炎症小体组分caspase-1对MPTP/p诱导的DA能神经元损伤的影响及其机制。方法：Western blotting方法检测MPTP/p对小鼠中脑组织caspase-1蛋白表达的影响。应用3～4月龄Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠建立慢性MPTP/p PD模型,Nissl’s染色观察MPTP/p对两种基因型小鼠中脑SNc区神经元形态和数目的改变。TH免疫组化检测MPTP/p对两种基因型小鼠中脑SNc区DA能神经元数目的改变,并结合体视学计数进行定量分析。采用转棒、爬杆和开场的小鼠行为学方法评价Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠在基础状态和MPTP/p模型下运动协调能力。Western blotting方法检测小鼠中脑凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶7(Cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-7)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly (ADP-ribose) polymerase1,PARP1)和凋亡诱导因子(Release of apoptosis inducing factor, AIF)蛋白的表达。离体培养孕13～16天Caspase-1+/+和Caspase-1-/-小鼠中脑原代神经元,并给予10μM MPP+刺激12 h,TH免疫组化检测神经元数目和突起长度。培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y神经元细胞株,给予caspase-1特异性活性抑制剂Z-YVAD 10μM预孵育1 h后,200 μM MPP+刺激48 h,收集细胞蛋白,western blotting方法检测caspase-1、Bcl-2和Bax蛋白的表达。在SH-SY5Y细胞株上给予Z-YVAD 10μM预孵育1 h后再用200μM MPP+刺激48 h,采用Annexin-V和PI双染并结合流式细胞仪检测细胞凋亡率；应用MTT法检测细胞活力；并应用Hoechst 33342荧光染色观察凋亡细胞；同时结合western blotting方法检测Z-YVAD对MPP+介导的caspase-7、PARP1和AIF蛋白表达的影响。应用Real-timePCR和双酶切技术在人源性SH-SY5Y细胞株构建3HA-cleaved caspase-7质粒,通过在SH-SY5Y细胞上过表达cleaved caspase-7并结合流式细胞术和western blotting方法观察其对MPP+介导的细胞凋亡的影响。结果：1)与生理盐水组相比,MPTP/p诱导小鼠中脑成熟体caspase-1蛋白表达上调,而对procaspase-1的表达无影响；2)基础状态下,caspase-1基因缺失对小鼠中脑SNc区神经元数目以及TH神经元数目无显著影响；caspase-1基因缺失可显著抑制MPTP/p诱导的小鼠中脑SNc区TH神经元的丢失；3)Caspase-1基因缺失可显著改善MPTP/p诱导的小鼠运动功能障碍；4)Caspase-1基因缺失可改善MPTP/p诱导的抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调、抑制Bax表达上调的现象；5)Caspase-1基因缺失通过抑制MPTP/p介导的caspase-7的切割,进而抑制PARP1/AIF信号通路的激活,发挥抗凋亡的保护作用；6)Caspase-1基因缺失改善MPP+诱导的中脑TH神经元数目的丢失和突起长度缩短的现象；7)Caspase-1抑制剂Z-YVAD (10μM)可抑制MPP+(200μM诱导的SH-SY5Y中成熟体caspase-1蛋白表达上调的现象,并可上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并下调促凋亡蛋白Bax的表达；8)Z-YVAD抑制MPP+介导的SH-SY5Y神经元细胞的凋亡；9)SH-SY5Y细胞过表达cleaved caspase-7显著抑制Z-YVAD所发挥的抗神经元凋亡的作用,并促进PARP1入核和胞浆内AIF的表达上调。结论：1)MPTP/MPP+可诱导procaspase-1切割成caspase-1,提示成熟体caspase-1参与PD病理反应；2)Caspase-1基因缺失抑制MPTP/p诱导的小鼠中脑DA能神经元丢失和运动功能障碍；3)Z-YVAD抑制caspase-1的活性,抑制caspase-7活化介导的PARP1/AIF信号通路的激活,发挥抗神经元凋亡的保护作用。综上所述,本文工作的主要创新之处在于：1.发现NLRP3-Caspase-1炎症小体激活与PD发生的相关性研究发现PD患者和MPTP PD小鼠模型中存在炎症小体激活的现象；其中NLRP3炎症小体激活在PD的发生过程中发挥主要的调控作用；应用小干扰RNA技术抑制小鼠中脑SNc区NLRP3蛋白的表达,可显著减轻MPTP介导的DA能神经元丢失和胶质细胞增殖活化的现象,为靶向NLRP3炎症小体激活而缓解PD的临床药物研发积累了学术基础。2.阐明星形胶质细胞ATP13A2抑制NLRP3-Caspase-1炎症小体活化,减轻PD进程中的神经炎症研究从整体、细胞和分子水平阐明Atpl3a2基因缺失可诱导星形胶质细胞炎症反应,促进星形胶质细胞溶酶体释放cathepsin B激活NLRP3炎症小体,加剧DA能神经元损伤,从而阐明Atpl3a2基因突变参与PD发生的病理机制,并揭示星形胶质细胞中的ATP13A2参与调控神经炎症反应,为靶向神经炎症的药物在Kufor-Rakeb综合征或溶酶体功能障碍类疾病的神经保护治疗的研究提供了实验基础。3.揭示靶向调控caspase-1发挥抗DA能神经元凋亡的新机制研究进一步阐明敲除炎症小体关键性组分caspase-1可缓解PD病理进程中DA能神经元损伤,并从细胞和分子水平阐明caspase-1特异性活性抑制剂通过调节caspase-7/PARP1/AIF信号通路发挥抗神经元凋亡的保护作用,并揭示caspase-7成熟体是caspase-1介导凋亡信号所必需的关键分子,为抗凋亡药物在PD神经保护治疗中的研发提供了新的靶标和策略。