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本研究通过核黄素合成途径的构建,中心碳代谢的改造及发酵条件的优化的策略,研究了大肠杆菌生产核黄素的代谢能力;其次,利用基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,在大肠杆菌的基因组上整合β-胡萝卜素合成基因,对MEP途径、中心碳代谢途径进行组合改造,获得高产β-胡萝卜素的工程菌。首先,考察大肠杆菌自身核黄素合成基因在不同拷贝数质粒中表达对核黄素产量的影响,并与枯草芽孢杆菌核黄素合成基因比较。通过发酵验证,发现大肠杆菌自身核黄素合成基因在高拷贝质粒过表达更有利于核黄素的积累。5-磷酸核酮糖是核黄素合成的重要前体物。为了提高5-磷酸核酮糖的供给,本文对氧化磷酸戊糖途径、糖酵解途径以及ED途径(Entner-Doudoroff Pathway)进行了系统地研究。研究发现,过表达来源于谷氨酸棒杆菌的突变型zwf243和gnd361基因不能有效的提高核黄素产量;进一步过表达大肠杆菌內源pgl基因能够进一步提高核黄素的产量;敲除糖酵解途径中pgi基因构建RF02S,使得核黄素的产量提高了72.4%,进一步失活ED途径使得核黄素的产量提高41.8%;过表达acs基因能够有效的降低副产物乙酸的积累,对核黄素的产量没有明显的影响。最终获得工程菌RF05S在以10g/L葡萄糖为底物的LB培养基中能够积累585.2±13.6mg/L核黄素。为了防止过多的核黄素转化为FMN和FAD,在不影响菌体生长的情况下提高核黄素的产量,通过对催化该反应的酶基因ribF的RBS强度进行微调。获得工程菌RF05S-M40的核黄素激酶活性是出发菌株的64.8%,核黄素的产量达到1019.6±25.3mg/L。考察RF05S-M40在不同的发酵条件及发酵培养基对核黄素产量的影响。利用优化的培养基,RF05S-M40能够积累2702.8±89.9 mg/L得率137.5 mg/g glucose,是迄今为止报道的核黄素得率最高工程菌株。本文第二部分利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术,将β-胡萝卜素合成基因整合到基因组上,对MEP途径进行组合调控以增强IPP和DMAPP的合成,获得工程菌ZF43能够积累21.45±0.46mg/Lβ-胡萝卜素。G3P和Pyr是MEP途径的直接前体物,NADPH是β-胡萝卜素合成的重要辅因子。为了提高这些代谢物的供给,对中心碳代谢、MEP途径及β-胡萝卜素合成途径进行组合优化,获得高产β-胡萝卜素的工程菌ZF237T,高密度发酵能够获得2.02g/Lβ-胡萝卜素。首次在大肠杆菌中将CRISPR/Cas9系统成功的应用于代谢工程改造,并获得高产菌种。