论文部分内容阅读
1研究背景心室重塑是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后发生慢性心力衰竭(heart failure,HF)的中心环节。心室重塑不仅归因于心肌细胞的凋亡、肥大,纤维组织的形成也发挥了重要作用,目前调控纤维化发生、发展的具体机制仍未完全揭示。较多文献报道1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)与心肌缺血/再灌注、冠心病、AMI之间有密切关系。目前在心脏组织发现有S1P1、S1P2、S1P33种S1P受体表达。研究发现:在缺氧条件下S1P对心肌细胞具有保护作用;体外实验证实S1P对心肌细胞的保护作用可能是通过S1P1作用实现;近期有文献报道S1P1信号通路在调节AMI后心肌炎症反应过程起重要作用;另外,通过体内、体外研究证实:S1P2、S1P3信号参与了心脏纤维化的进程。基于文献分析我们发现:S1P通过受体产生促进心肌细胞存活和加剧心肌纤维化的双重作用。我们推断:在正常心肌组织中S1P受体的表达处于一种平衡状态,这种状态参与维持心脏的正常组织形态及功能。那么,AMI后心室重塑的进程中是否存在S1P1、S1P2、S1P3表达失衡?它们在心脏非梗死区、梗死区的表达变化趋势是否一致?通过调节S1P受体是否能够抑制心室重塑的发生、发展?上述问题报道较少且存在争议,特别是梗死区上述3种受体的表达变化尚未发现文献报道。本研究旨在对上述3个问题进行探讨,通过在体研究干预S1P及下游信号,为改善AMI患者预后提供新的思路。2研究目的(1)探讨AMI后心室重塑阶段非梗死区、梗死区S1P1、S1P2、S1P3的表达变化。(2)通过干预S1P受体观察对AMI后心室重塑和心功能的影响。3研究方法(1)实验一:采用体重在220g~250g雄性SD大鼠,随机分为:假手术组、心梗组,采取开胸结扎左侧冠状动脉的方法建立心梗后心衰模型。术后8周,通过HE染色、Masson染色、血清BNP(brain natriuretic peptide)检测、记录心电图、心功能测定等手段,对这种造模方法的可靠性进行验证。(2)实验二:实验动物随机分为4组:正常对照组、1周梗死组、4周梗死组、8周梗死组,按照实验一的方法构建模型。采用实时荧光定量PCR技术及酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)的检测方法,对正常心脏以及心梗后1周、4周、8周三个时间点大鼠心脏组织中S1P1、S1P2、S1P3m RNA和蛋白表达进行检测。(3)实验三:实验动物随机分为4组:假手术组(Sham组)、AMI组、Sham+SEW2871组、AMI+SEW2871组。对Sham+SEW2871组、AMI+SEW2871组,经口给予S1P1特异性激动剂SEW2871,剂量:7mg/kg/d,直至处死前。术后8周,通过心脏超声测定心功能,激光多普勒检测心脏微循环灌注,ELISA法检测血清心衰标志物BNP变化,Masson染色评估胶原容积分数。(4)统计学方法:计量资料数据采用均数±标准差(Mean±SD)的表示方法,利用Graph Pad Prism6.02软件对数据进行统计学分析。采用t检验对单因素两组之间进行数据分析,采用方差分析法对单因素多组间进行两两比较,当P<0.05认为具有统计学差异。4研究结果(1)实验一:(1)结扎左侧冠状动脉的造模方法能够保证较高的动物存活率,本研究中假手术组、心梗组大鼠存活率分别为:75.0%、72.5%。(2)心梗组左冠脉结扎5分钟后可记录到心电图I、II、a VL导联出现J点上移超过0.1mv,ST段抬高(多为弓背向上型)0.2mv以上,假手术组无上述变化。(3)术后8周心脏超声检测:心梗组左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS):29.20±1.75%,假术组:33.17±1.32%,心梗组LVFS低于假手术组(P<0.01);心梗组左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF):63.24±1.88%,假手术组:71.12±0.79%,心梗组LVEF均低于假手术组(P<0.01)。(4)HE染色可见梗死部位心室壁明显变薄,肌纤维被疏松结缔组织取代,残存肌细胞增生,成纤维细胞增生,血管增生充血明显。(5)Masson染色显示心肌梗死区域残存心肌之间纤维瘢痕形成,呈交错分布。(6)术后8周,心梗组与假手术组血清BNP水平分别为:648.44±9.37ng/m L、541.65±33.34ng/m L,心梗组明显高于假手术组(P<0.01)。(2)实验二:(1)在AMI后1周、4周、8周三个时间点,分别检测S1P1的m RNA和蛋白表达,并与正常对照心肌组织(m RNA表达:33.34±6.80,蛋白表达:295.3±57.22 ng/g)比较,发现:梗死区中S1P1的m RNA和蛋白表达水平在1周组(m RNA表达:28.47±8.01,蛋白表达:240.7±47.22ng/g)、4周组(m RNA表达:13.70±5.25,蛋白表达:137.4±17.04 ng/g)均降低(P<0.05)。(2)在AMI后1周、4周、8周三个时间点,分别检测S1P2的m RNA和蛋白表达,非梗死区中的S1P2m RNA表达水平在对照组(1405±169.60)和心梗不同时间点之间比较均无显著差异。相比之下,梗死区S1P2m RNA变化趋势却极为显著,降低趋势持续至术后4周(163.6±16.45)(P<0.01);非梗死区S1P2蛋白表达在心梗1周、4周组呈下降趋势,4周组(91.21±15.30ng/g)较对照组(180.9±34.00ng/g)明显下降(P<0.01),S1P2蛋白在梗死区不同组间比较无统计学差异(P>0.05)。(3)在AMI后1周、4周、8周三个时间点,分别检测S1P3的m RNA和蛋白表达,非梗死区的S1P3m RNA表达在梗死1周(565.7±30.85)较正常对照组(434.5±15.61)显著升高(P<0.05),至术后8周降低至正常对照组水平;梗死区S1P3m RNA表达在1周组升高(P<0.01),变化特点与非梗死区变化趋势相似;S1P3蛋白在梗死区和非梗死区表达均上调(P<0.05)。(3)实验三:(1)手术8周后,检测心脏多谱勒超声显示:AMI+SEW2871组与AMI组比较,LVFS、LVEF均增高,其中LVFS指标AMI+SEW2871组(32.12±0.89%)较AMI组(29.65±1.49%)增高(P<0.01),LVEF测量显示AMI+SEW2871组(66.32±1.60%)也较AMI组(62.32±1.69%)增高(P<0.01)。(2)手术8周后,激光多普勒血流仪扫描各组大鼠心脏表面血流量发现AMI+SEW2871组中的红色和黄色信号较AMI组明显增多,蓝色信号减少,测定灌注单位(perfusion units,PU)值:Sham组1015±96.17、AMI组688.9±70.19、Sham+SEW2871组985.4±46.47、AMI+SEW2871组823.2±110.80,AMI+SEW2871组PU值较AMI组增高(P<0.05)。(3)手术8周后,血清BNP检测,AMI+SEW2871组(638.2±38.99 ng/m L)较AMI组(650.7±34.06 ng/m L)有降低趋势,但差异无统计学意义。(4)手术8周后,Masson染色经图像分析获得胶原容积分数(%),AMI+SEW2871组(梗死区:34.33±4.43%,非梗死区:16.83±2.17%),AMI组(梗死区:40.80±6.92%,非梗死区:20.61±2.71%),梗死区和非梗死区的胶原容积分数显示,AMI+SEW2871组较AMI组均有降低趋势,但在仅梗死区两组之间有统计学差异(P<0.05)。5研究结论(1)首次较完整阐述了S1P1、S1P2、S1P33种S1P受体在大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭心肌组织中的变化趋势。(2)首次把S1P受体的研究扩展到心肌梗死区,进一步证实了S1P1、S1P2、S1P3表达失衡共同参与构成了AMI后心室重塑阶段的调控网络。(3)通过干预实验,我们发现上调S1P1可以改善大鼠AMI后心室重塑和心脏功能紊乱。证明:S1P受体在AMI后心室重塑阶段扮演重要角色,增强S1P1信号具有潜在的治疗价值。