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茶树中的儿茶素是对人体健康有益的重要的植物次生代谢产物。在植物体内,儿茶素及其他的类黄酮化合物是以苯丙氨酸为底物,经过苯丙烷代谢途径和类黄酮代谢途径产生的。类黄酮途径中,黄烷酮在F3H的作用下转变为相应的二氢黄酮醇,再由DFR催化为无色花青素,最后在无色花青素还原酶(LAR)的作用下生成儿茶素。本文克隆了茶树F3H、DFR1和DFR2基因,对它们进行了生物信息学分析、表达特异性分析、以及原核表达融合蛋白酶活性检测,并利用原核表达技术构建了能高效产生儿茶素的代谢工程菌。主要研究内容如下:1.茶树F3H基因的分子克隆和功能分析本文采用end-to-end PCR获取了茶树F3H的开放阅读框,包含1107个碱基,编码368个氨基酸。通过实时荧光定量PCR研究了CsF3H的表达特异性,结果表明CsF3H在四叶中的相对表达量最高,在遮阴诱导条件下表达下调。构建重组质粒pRSFDuet-F3H转化表达菌株BL21进行原核表达,并通过HPLC技术对融合蛋白进行了活性验证,结果表明,融合蛋白可将底物柚皮素转化为二氢山奈素,圣草酚转化为二氢槲皮素,因此具有F3H酶的活性。而且对圣草酚有明显的底物偏向性。2.茶树DFR基因的分子克隆和功能分析本文采用end-to-end PCR获取了茶树DFR1和DFR2的开放阅读框,其中CsDFR1的ORF序列包含1044个碱基,编码347个氨基酸;CsDFR2的ORF序列包含1035个碱基,编码344个氨基酸。通过实时荧光定量PCR研究了CsDFR1和CsDFR2的表达特异性,结果表明CsDFR1在芽和三叶中表达较高,在茎和根中相对较低;CsDFR2在二叶、三叶及根中表达量较高,茎中最低。在不同诱导条件下,两条基因的响应并不一致,其中CsDFR2更易受到干旱和紫外诱导处理的影响,其中干旱处理中上调了2.9倍,紫外处理中上调5.3倍;而CsDFR1则在遮阴条件下显著下降。构建重组质粒sumo-DFR1、sumo-DFR2,转化表达菌株BL21,利用IPTG诱导目的蛋白表达。通过HPLC技术对融合蛋白进行了酶活性验证,结果显示,融合蛋白有DFR酶的活性,可以将二氢黄酮醇转化为无色花青素。3.重组类黄酮关键代谢途径构建高产儿茶素大肠杆菌构建了两组重组质粒pETDuet-LAR和pRSFDuet-F3H-DFR1,pETDuet-F3H和pRSFDuet-LAR-DFR1,分别转化表达菌株BL21,形成重组的大肠杆菌FD-L(包含质粒pETDuet-LAR和pRSFDuet-F3H-DFR1)和F-DL(包含质粒pETDuet-F3H和pRSFDuet-LAR-DFR1)。通过饲喂底物柚皮素和圣草酚,来生产儿茶素类化合物。结果表明,当以柚皮素为底物时,可以获得B环一羟基儿茶素产物A;而以圣草酚作为底物时,可获得B环二羟基儿茶素产物C,最高产量可达61.10 mg/L。而无论以柚皮素或圣草酚为底物时,重组的大肠杆菌FD-L的活性总是略高于F-DL。