研究目的与背景在全球范围恶性肿瘤发病率中,结直肠癌发病率位居第三,仅次于肺癌与乳腺癌。且在结直肠癌确诊时,部分病人已发生远处转移,从而错失了手术的黄金时期。而发生远处转移的病人普遍生存率低且预后不良。结直肠癌的发病给病人家庭及社会造成沉重的负担,因此研究结直肠癌发生发展及其转移的相关分子机制,对结直肠癌转移进行早期诊断与治疗,对降低病人痛苦、提高生存率具有重要的意义。泛素酶体系统由E1(泛素激活酶)、E2(泛素结合酶)、E3(泛素连接酶)组成,共同参与蛋白的泛素化修饰从而被水解或失活。F-box家族属于泛素蛋白酶体系统E3(泛素连接酶)的成员,其主要参与蛋白的泛素化降解从而调控细胞的增殖、凋亡、代谢、运动及损伤修复等,参与几乎机体的一切生命活动,调控机体的稳态。F-box家族主要由三类F-box蛋白组成：Fbls?Fbws/Fbxs,其中Fbls蛋白组成成员有12个,为F-box家族最大的组成成员,其新成员包括FBL73、FBL7。FBX08(F-box protein 8,又名FBX8)为Fbxs家族的一个新成员,目前关于FBX08在肿瘤中的报道较少,FBX08为新的C-myc结合蛋白,C-myc通过抑制FBX08而促进细胞的侵袭[4]。乳腺癌中FBX08的异常表达引起其参与Arf6的泛素化异常而促进乳腺癌细胞的侵袭。本课题组前期研究表明FBX08在肝癌组织中低表达且抑制肝癌细胞的增殖与侵袭能力,可能成为临床治疗肝细胞癌的有效靶点。由此可见,FBX08与肿瘤发展与侵袭转移关系密切。本课题选取FBX08泛素化作用为切入点,通过筛选FBX08的下游的泛素化靶蛋白探讨其相关的结直肠癌发生发展机制。主要内容如下：1,筛选FBX08的下游泛素化靶蛋白；2,探讨FBX08与GSTP1的相互作用关系,证实FBX08对GSTP1的泛素化作用；3,探讨GSTP1在FBX08诱导结直肠癌侵袭转移中的作用；4,明确GSTP1在结直肠癌侵袭转移中的表达及对结直肠癌细胞生物学行为的影响。本课题目的为探讨FBX08在结直肠癌侵袭转移中的机制研究,为临床结直肠癌的治疗提供靶点。研究方法1、FBX08下游泛素化靶蛋白的筛选(1)构建FBX08过表达质粒,转染进人胚胎肾细胞株293T之后qRT-PCR与Western-Blot实验验证其转染效率。(2)IP(Immunoprecipitation)实验分离出FBX08的结合蛋白后,运用质谱分析技术将结合蛋白进行肽段分析,得出可能的FBX08下游泛素化靶蛋白。2、探讨FBXO8与GSTP1的相互作用关系,证实FBX08对GSTP1的泛素化作用(1)运用co-IP(co-Immunoprecipitation)与免疫荧光共聚焦实验,检测FBX08与GSTP1的结合情况。(2)用蛋白酶体抑制剂MG132处理结直肠癌细胞SW620和SW620/FBXO8, Western-Blot检测GSTP1的蛋白含量改变。(3)过表达或干扰FBX08后检测下游GSTP1蛋白含量的改变。(4)将结直肠癌细胞转染过表达ubquitin的载体,检测FBX08的表达对GSTP1泛素化水平的影响。(5)构建GSTP1截短子。3、探讨GSTP1在FBX08诱导结直肠癌侵袭转移中的作用(1)构建FBX08与GSTP1共同过表达与共干扰细胞株,qRT-PCR与Western-Blot实验验证其过表达与干扰效率。(2)MTT实验、transwell侵袭实验及裸鼠尾静脉转移实验检测GSTP1在FBXO8诱导结直肠癌增殖侵袭转移中的恢复作用。4、明确GSTP1在结直肠癌组织中的表达及对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)qRT-PCR检测20例新鲜结直肠癌组织及其配对正常组织中GSTP1在mRNA水平上的表达。(2)免疫组化检测GSTP1在136例结直肠癌组织及正常组织的表达,并分析GSTP1表达在正常组织与肿瘤组织中的表达差异和对结直肠癌分化、远处转移、淋巴结转移、预后的影响。(3)qRT-PCR与Western-Blot检测6株结直肠癌细胞株中GSTP1的内源性表达,选取高表达细胞株转染siRNA进行干扰,选取低表达细胞株转染慢病毒上清使GSTP1过表达,Western-Blot与qRT-PCR验证其干扰与过表达效率。(4)运用MTT实验、transwell侵袭实验、裸鼠尾静脉转移实验检测过表达或干扰GSTP1在体内外对结直肠细胞增殖侵袭转移能力的影响。运用细胞流式检测过表达或干扰GSTP1对结直肠癌细胞株凋亡的影响。实验结果：1、FBXO8泛素化靶蛋白筛选构建pEGFP-C1/FBXO8过表达质粒,其插入片段大小为960bp,测序结果及琼脂糖凝胶电泳显示质粒构建成功。将构建的FBX08过表达质粒转染进293T细胞,效率验证结果经独立样本t检验,显示FBX08在293T细胞中过表达2736倍(t=665.8,P<0.001)。IP实验与质谱分析结果初步得出三个分子：NFX1、GGT7、GSTP1。因GSTP1的肽段比对得分高且重复性好,因此将其选为FBX08结合蛋白进行研究。2、FBX08泛素化降解GSTP12.1 FBX08与GSTP1的结合情况(1)将结直肠癌细胞株HCT116的两种蛋白FBX08与GSTP1分别用两种荧光抗体标记：FBX08(绿色)和GSTP1(红色),con-focal结果显示,FBX08胞浆表达,GSTP1在胞浆胞核均有表达,FBX08与GSTP1在胞浆存在共定位。(2)人胚胎肾细胞株293T中co-IP实验结果显示：FBX08能够拉下GSTP1,GSTP1能够拉下FBXO8,说明FBX08与GSTP1存在相互作用。2.2 FBXO8表达对GSTP1蛋白的影响(1)结直肠癌细胞株SW480转染FBXO8过表达质粒后,Western-Blot结果显示GSTP1的蛋白含量降低。(2)结直肠癌细胞株SW620转染干扰FBXO8表达的siRNA后,Western-Blot结果显示GSTP1的表达量升高。2.3蛋白酶体抑制剂MG132对GSTP1表达的影响在裸细胞SW620与FBX08过表达细胞株SW620/FBXO8中,Western-Blot结果显示MG132处理的细胞中GSTP1的表达量均较高,说明FBXO8降解GSTP1依赖泛素蛋白酶体途径。2.4 GSTP1截短子的构建测序结果显示GSTPl的三个截短子GSTP1-C端(252-630a)、GSTP1-N端(9-228a)、GSTP1-PTZ (22-588a)构建成功。(截短子的co-IP实验正在进行中)3、GSTPl逆转FBX08在结直肠癌增殖侵袭与转移中的作用(1)成功构建SW480/FBXO8/GSTP1共表达细胞,体外实验结果经析因方差分析,过表达GSTP1能够恢复FBX08过表达对SW480细胞增殖的抑制作用(FTime=453.149,PTimer<0.001;FCells=197.89, P Cells<0.001;FTime×Cells= 26.039,PTime×Cells<0.001);经one-way ANOVO分析,过表达GSTP1能够恢复FBX08过表达对SW480细胞侵袭的抑制作用(F=68.235,P<0.001)；体内实验显示过表达GSTP1能够恢复FBXO8过表达对SW480裸鼠体内肺转移的抑制作用(F=5.477,P=0.016)。(2)成功构建SW620/siFBXO8/siGSTPl双干扰细胞株,体外实验结果经析因方差分析,干扰GSTP1能够逆转干扰FBX08对SW620细胞增殖的促进作用(FTime=819.974,PTimer<0.001; FCells=81.03,Pcells<0.001; FTime×Cells= 10.296,PTime×Cells<0.001);经one-way ANOVO分析,干扰GSTP1能够逆转干扰FBX08对SW620细胞侵袭的促进作用(F=27.447,P<0.001)。4、GSTP1在结直肠癌中的表达及其对增殖侵袭的影响4.1 GSTP1在结直肠癌组织中的表达(1)qRT-PCR检测20对新鲜配对组织中结直肠癌组织与配对组织中GSTP1mRNA的含量。2-△△Ct值通过配对样本t检验分析,结果显示：GSTP1在肿瘤组织中的表达明显高于周围正常组织(t=2.477,P<0.05)。(2)免疫组化结果显示：在正常配对组织中GSTP1集中在胞核表达,在结直肠癌组织中GSTP1在胞浆和胞核中均有表达。卡方检验显示GSTP1在癌组织中的表达明显高于周围正常组织,(P<0.001)。生存分析显示高表达GSTP1的患者具有较低的生存率(P=0.007)。4.2 GSTP1对结直肠癌细胞体内外生物学行为的影响(1)结直肠癌细胞株SW620、SW480、HCT116、RKO、lovo、HT29中,GSTP1在SW480、RKO、Lovo细胞株中表达较低,而在HCT116、SW620细胞株中表达较高。(2)对内源性表达量低的细胞株SW480、RKO进行GST TP1过表达,独立样本t检验分析,其中SW480细胞中过表达401.9倍,(t=19.43,P=0.000),RKO细胞中GSTP1过表达53.32倍,(t=13.43,P=0.0002)。对内源性表达量高的细胞株SW620、HCT116进行GSTP1的干扰,one-way ANOVO分析,其中SW620中S1、S2、S3的干扰效率分别为0.465,0.3603,0.769,(F=121.056,P<0.001),HCT116中S1、S2、S3的干扰效率分别为0.2042,0.1749,0.9681,(F=300.961,P<0.001),证明干扰片段S1、S2的干扰效率较强。(3)过表达GSTP1之后体外增殖实验结果经析因方差分析,过表达GSTP1显著促进SW480、RKO的体外增殖能力(FTime=741.627,PTime<0.001;FCells=186.139, Pcells<0.001; FTime×Cells= 47.391,PTime×Cells<0.001;FTime=283.834, PTime<0.001;Fcells=117.041, PCells<0.001; FTime×Cells= 13.922,PTime×Cells<0.001);过表达GSTP1之后体外侵袭实验结果经独立样本t检验,过表达GSTP1显著促进SW480、RKO的体外侵袭能力(t=10.17,P<0.0001;t=-11.14,P<0.0001)。(4)干扰GSTP1(选取干扰片段S1、S2)后体外增殖实验结果经析因方差分析,干扰GSTP1显著抑制SW620、HCT116的体外增殖能力(FTime=806.115, PTime<0.001;FCells=292.199,PCells<0.001;FTimexCells= 44.787,PTime×Cells<0.001;FTime=156.783, PTime<0.001;Fcells=152.425,PCells<0.001;FTime×Cells= 10.635,PTime×Cells<0.001);干扰GSTP1之后体外侵袭实验结果经one-way ANOVO分析,干扰GSTP1显著抑制SW620、HCT116的体外侵袭能力(F=72.831,P<0.001；F=608.011,P<0.001)。干扰GSTP1之后,细胞流式结果经独立样本t检验分析,与SW620/NC相比,SW620/siGSTP1的凋亡明显增加(t=4.456,P=0.0112),即GSTP1抑制结直肠癌细胞凋亡。(5)过表达GSTP1之后体内实验结果经独立样本t检验分析,裸鼠尾静脉转移实验中GSTP1显著增强lovo细胞在裸鼠体内的转移能力(t=-2.319,P=0.043)。结论1.GSTP1为FBXO8的一个新的泛素化底物蛋白,FBX08通过泛素化降解GSTP1抑制结直肠癌增殖、侵袭与转移;2.GSTP1在结直肠癌组织中表达上调且与患者的较差预后相关,GSTP1促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭与转移能力。