骨质疏松症是一种以骨组织的微结构变化、骨量减少、脆性增加以及骨强度降低为代表的全身性骨代谢疾病。其由于高发病率已成为全世界的公共卫生问题。越来越多的证据表明骨质疏松症主要是由于破骨细胞和成骨细胞控制骨的吸收与骨形成之间的骨稳态失调引起的。大量的研究显示胆固醇会影响骨质疏松的发生,这说明胆固醇（Cholesterol,CHO）参与骨代谢。然而,胆固醇与骨代谢和破骨细胞分化的关系存在争议。越来越多的研究表明CHO在自噬中起重要作用,最近的研究表明自噬参与骨质疏松症与骨稳态的维持,PI3K/Akt/mTOR信号传导途径是参与骨代谢和细胞自噬的重要途径之一,特别是与破骨细胞决定的骨吸收显著相关。但是,自噬在破骨细胞分化中的作用和机制尚不清楚。本论文中通过给予SD大鼠高胆固醇饮食及PI3K抑制剂LY294002处理,研究胆固醇对大鼠骨代谢的影响及机制,并利用破骨细胞分化因子RANKL孵育RAW264.7细胞构建体外破骨细胞分化模型,探讨胆固醇对破骨细胞分化的影响,明确PI3K/Akt/mTOR信号通路和自噬在胆固醇影响的破骨细胞分化过程中的作用。第一部分胆固醇对雄性SD大鼠骨代谢的影响目的:PI3K/Akt信号通路可以调节骨的形成和骨的吸收维持骨稳定,胆固醇又可以影响骨代谢,那么胆固醇是否可以通过调节PI3K/Akt信号通路对骨代谢起到作用是一个值得探究的问题。因此本章旨在通过高胆固醇饮食饲养大鼠,同时通过腹腔注射PI3K抑制剂LY294002,研究胆固醇及PI3K/Akt信号通路在调节骨稳态过程中的作用。方法:（1）构建大鼠模型,将动物分为普食组（ND）、普食+LY294002组（NL）、高胆固醇饮食组（HC）、高胆固醇+LY294002组（HL）。（2）研究不同处理对动物体成分、骨密度、骨微结构、生化指标、骨吸收和骨形成以及骨强度的影响。结果:（1）胆固醇对体重和体成分的影响:高胆固醇饮食组（HC和HL组）的体重和体脂变化不明显。（2）胆固醇降低了骨密度,破坏骨微结构:高胆固醇的引入降低了骨小梁的骨密度（HC组）,破坏了骨小梁骨微结构,而抑制PI3K后的高胆固醇+LY294002组（HL组）骨密度较高胆固醇组（HC）骨小梁的骨密度上升,骨微结构改善,差异有统计学意义。（3）胆固醇促进了骨吸收,提高了骨转换:高胆固醇饮食组（HC组）骨形成标志物PINP以及骨吸收标志物CTX-1相对于ND组均明显升高。同时,抑制PI3K活性的HL组较HC组降低了骨吸收相关标志物CTX-1和骨形成相关标志物PINP的表达,并且具有统计学差异。（4）胆固醇降低了骨强度:研究不同组别大鼠骨强度相关指标,高胆固醇组（HC组）最大负荷、最大断裂负荷、最大拉伸强度低于普食对照组,有统计学差异。HL组骨强度指标较HC组有所改善,但差异无统计学意义。结论:高胆固醇饮食对骨代谢具有一定的影响,可以促进骨吸收,降低骨密度,损害骨微结构。而且这一过程可能与PI3K/Akt通路有关。第二部分胆固醇在RANKL诱导的破骨细胞分化中的作用探究目的:CHO与成骨细胞和破骨细胞实现的骨平衡显著相关,然而,CHO对破骨细胞分化的影响还需进一步确定。因此,本部分研究旨在探究CHO对破骨细胞分化的影响及体外培养诱导破骨细胞分化的最适宜浓度。方法:（1）RANKL单独或联合不同浓度的胆固醇诱导RAW264.7细胞破骨细胞分化。（2）Western blot检测不同组别中TRAP蛋白的表达;qRT-PCR和Western blot分别检测破骨细胞分化标志物NFATC1、ACP5和CTSK在mRNA和蛋白水平上的表达。（3）TRAP染色法检测胆固醇对破骨细胞的分化的影响。结果:（1）胆固醇促进了 RAW264.7细胞中TRAP蛋白的表达:通过检测10μg/mL、20μg/mL和40μg/mL CHO对RANKL处理的RAW264.7细胞中TRAP蛋白表达的影响,发现在用50 ng/mL RANKL联合20ug/mL CHO刺激RAW264.7细胞5天时,TRAP蛋白的表达量增加最为明显。（2）胆固醇对RAW264.7细胞破骨细胞分化的影响:RAW264.7细胞经过RANKL孵育后的破骨细胞数量明显增加;然而,与RANKL组相比,在RANKL+CHO组中破骨细胞的数量增加更显著。（3）胆固醇上调RAW264.7细胞破骨细胞分化标志性mRNA和蛋白表达:通过分析破骨细胞分化标志物NFATC1、ACP5和CTSK相关基因和蛋白表达发现,与对照组相比,RANKL诱导组中NFATC1,ACP5和CTSK的表达显著增加。与RANKL诱导组相比,RANKL+CHO组NFATC1,ACP5和CTSK的表达进一步增加。结论:胆固醇可促进RANKL诱导RAW264.7细胞的破骨细胞分化,且胆固醇的浓度在20μg/mL时,能最大程度地提高RAW264.7细胞向破骨细胞的分化效率。第三部分 胆固醇在RANKL诱导的破骨细胞分化中的分子作用机制探究目的:CHO通过调节破骨细胞的分化和形成来影响骨稳态。然而,CHO调节破骨细胞分化的机制尚不明确。因此,本章节的目的是探究CHO诱导破骨细胞分化的调控机制。方法:（1）使用PI3K抑制剂（LY294002）以及自噬激活剂雷帕霉素（RAPA）分别研究PI3K信号通路及自噬在CHO促进RAW264.7细胞向破骨细胞分化中的作用;（2）qRT-PCR和Western blot检测破骨细胞分化相关基因和蛋白的表达以及自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路中所涉及蛋白的表达水平;（3）TRAP染色检测破骨细胞分化能力,蚀骨实验检测各组细胞骨吸收陷窝形成能力,F-actin免疫荧光检测各组细胞成环能力;（4）通过LC3B免疫荧光实验以及生物透射电镜证明CHO对RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中自噬的影响。结果:（1）CHO激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬:与对照组和RANKL组比,RANKL联合CHO组细胞中的磷酸化蛋白p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达最多,而经过RANKL+CHO+LY294002处理后的细胞中的p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达降低;与对照组和RANKL诱导组相比,CHO处理组中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B-Ⅱ的表达显著降低,P62和LC3B-Ⅰ蛋白的表达水平升高,而RANKL+CHO+LY294002组自噬水平较CHO组增强。（2）CHO激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进破骨细胞分化:RAW264.7细胞经RANKL联合胆固醇处理组TRAP染色破骨细胞数、骨吸收陷窝、F-actin环及破骨分化标志基因和蛋白最多,PI3K抑制剂LY294002处理组均减少。（3）CHO抑制自噬促进破骨细胞分化形成:RAW264.7细胞经CHO、RAPA及两者的联合干预RANKL诱导的破骨细胞发现,细胞经RANKL联合胆固醇处理后LC3B免疫荧光较弱,自噬小体及自噬相关蛋白的表达较少,TRAP阳性细胞数、骨吸收陷窝及破骨相关基因和蛋白的表达增多。RANKL+CHO+RAPA处理组LC3B免疫荧光增强,自噬小体及自噬相关蛋白的表达增多,TRAP阳性细胞数、骨吸收陷窝及破骨相关基因和蛋白的表达减少。结论:胆固醇可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节自噬促进破骨细胞分化。