目的：原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第三大导致死亡的恶性肿瘤。HCC发生的其中一个危险因素是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染。目前全世界约有4亿人感染HBV，中国约占1/3。HBV基因组由部分环状的双链DNA组成，全长约为3.2kb，基因组包含4个开放阅读框架，分别为C、P、S和X区。乙型肝炎病毒X基因（Hepatitis B virus X, HBx）编码154个氨基酸，在病毒的复制等方面发挥重要作用。大量的研究报道表明，HBx蛋白在HCC的发生中发挥重要的作用。作为一个多功能的调节因子，HBx能够和细胞核内的转录因子相互作用，从而影响细胞的转录活性。此外，HBx还可涉及一些信号转导通路，例如：Wnt/β-catenin, Ras/MAPK, SAPK/JNK,NF-κB, FAK等。Wnt/β-catenin信号通路调控着细胞的衰老、死亡、增殖、转移，以及在决定胚胎形态等方面都发挥着重要的作用。大量的研究表明，Wnt信号通路的异常活化可以参与肿瘤的发生，例如：肺癌、结肠癌等。以前也有研究表明，Wnt信号通路的异常活化也可导致肝癌的发生。在肝癌的发生中，除了Wnt/β-catenin信号通路组成部分的基因突变外，一些表观遗传修饰也可导致这条信号通路的异常活化。分泌卷曲相关蛋白（Secreted frizzled-related proteins, SFRPs)是一种Wnt信号的拮抗因子。SFRPs家族共有5个分泌性糖蛋白家族成员，包括SFRP1~5，由约300个氨基酸残基组成。有研究报道表明，由于SFRPs启动子区甲基化导致其表达的下调，在HBV相关的HCC中发挥重要作用。相反，回复SFRP1的表达，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力。这些数据表明，SFRPs基因的表观沉默表达，在由Wnt/β-catenin信号通路异常活化导致的HCC中发挥重要作用。也有研究报道表明，HBx也能够激活Wnt/β-catenin这条信号通路，但是其在表观沉默SFRPs从而导致肝癌的发生等方面，目前还未见相关的报道。本研究拟在细胞水平和肿瘤组织标本中观察HBx对SFRPs的表观调控，从而进一步研究HBx导致肿瘤发生的分子机制。方法：收集临床肝癌组织标本，提取癌组织DNA、RNA和总蛋白，通过RT-PCR、western blot检测肿瘤组织与癌旁组织中SFRP1和SFRP5的表达情况，进一步采用甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）及亚硫酸盐测序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP），检测肝癌组织中SFRP1、SFRP5启动子区的甲基化表达情况。同时观察感染HBx的肿瘤细胞株SFRP1、SFRP5启动子活性变化，进一步证实HBx能否调控SFRP1、SFRP5的表达。通过体外功能实验研究回复SFRP1、SFRP5或干扰甲基化修饰酶Dnmt1后肝癌细胞的增殖和迁移能力变化，探讨HBx蛋白调控SFRP1、SFRP5的分子机制。结果：我们在重庆医科大学附属第二医院收集到35例原发性肝癌组织标本，分别提取肿瘤和癌旁组织的总RNA、DNA、总蛋白，观察到与癌旁组织相比，肿瘤组织Wnt信号抑制分子SFRP1、SFRP5的表达明显下调，甲基化特异性PCR以及亚硫酸盐测序PCR实验均表明肿瘤组织与癌旁组织相比，SFRP1和SFRP5启动子区甲基化修饰显著增高。体外构建成功含SFRP1和SFRP5区的启动子截短突变报告质粒，采用双荧光素酶报告基因法检测，结果表明SFRP1、SFRP5启动子区在转录起始位点400bp左右启动子活性最强。感染HBx后，SFRP1、SFRP5的启动子活性明显低于对照组。在体外功能实验中，平板克隆形成实验、MTS实验、Brdu掺入实验、结晶紫实验均可证实，稳定表达HBx的肝癌细胞系，HBx蛋白可以明显促进肝癌细胞增殖，并且干扰Dnmt1或者回复SFRP1、SFRP5能够抑制肝癌细胞的增殖作用。迁移实验结果表明，HBx蛋白能够增强肝癌细胞系Huh7细胞的迁移的能力，干扰Dnmt1或者回复SFRP1和SFRP5的表达能够抑制肝癌细胞的迁移能力。结论：乙型肝炎病毒X蛋白通过降低SFRP1、SFRP5的启动子活性，明显下调Wnt信号抑制分子SFRP1、SFRP5的表达。HBx促进肿瘤细胞的增殖和迁移能力与活化DNA甲基转移酶下调SFRPs的表达进而活化Wnt信号相关。